مقاله – کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- …

شکل ۴-۳ الکتروفورز پلاسمید های استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73
شکل ۴-۴ نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن…………………………………………………………………………………….۷۴
شکل ۴-۵ محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………75
شکل ۴-۶ ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده ………………………………………………………………………………..۷۶
فهرست نمودارها
عنوان شماره صفحه
نمودار ۴-۷ منحنی استاندارد غلظت تیروزین …………………………………………………………………………………۷۷
نمودار ۴-۸ تأثیر pH بر روی فعالیت سراپپتیداز …………………………………………………………………………….۷۸
نمودار ۴-۹ اثر دما بر روی فعالیت سراپپتیداز ………………………………………………………………………………..۷۹
نمودار ۴-۱۰ منحنی میکائیلیس-منتن از فعالیت پروتئازی ……………………………………………………………….۸۰
فصل اول
کلیات
مقدمه
پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند و بطور گسترده در صنایع مختلف از جمله موادغذایی، موادشوینده، داروسازی، چرمسازی و… مورد استفاده قرار می گیرند (Ghaemi et al, 2005). از جمله موارد حائزاهمیت کمبود این آنزیم، قلیایی شدن بیش از حد خون می باشد بطوریکه قلیایی شدن این محیط باعث اضطراب و بی خوابی می شود وهم چنین کمبود آن سبب ورم مفاصل و پوکی استخوان ودیگر بیماری های کمبود کلسیم می شود. از آنجایی که پروتئین تبدیل به گلوکز می شود و هضم پروتئین ناکافی منجر به هیپو گلیسمی می شود. با توجه به مطالب فوق از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند و پزشکان در سراسر اروپا و آسیا مزایای ضد التهابی و ضد درد این ماده را به رسمیت شناخته اند و از آن به عنوان جایگزین سالیسیلات ها، ایبوپروفن و سایر داروهای ضد درد غیراستروئیدی در درمان استفاده می شود ( Mazzone ,1990).
منابع تولید آنزیمها بسیار متنوع است. بطوریکه از صد ها آنزیمی که بطور تجاری استفاده می شود بیش از نیمی از آنها از قارچ و مخمر و بیش از یک سوم آنها از باکتری ها و باقی مانده از گیاهان و حیوانات حاصل می شود. بنا به دلایل زیر میکروبها به عنوان منابع آنزیمی نسبت به گیاهان و جانوران ترجیح داده می شوند:۱- عموما تولید آنها ارزانتر است ۲- آنزیمهای حاصل از آنها قابل پیش بینی و قابل کنترل تر هستند، ۳- بافتهای گیاهی و جانوری نسبت به میکروارگانیسم ها مواد مضر بیشتری دارند (مانند ترکیبات فنلی در گیاهان، مهارکننده های داخل سلولی و پروتئازها)، ۴- نسبت به گیاهان و جانوران راحت تر می توان میکروب ها را از نظر ژنتیکی دستکاری نمود، ۵- میکروارگانیزم ها را می توان در مقادیر بالا و در یک مدت زمان نسبتا کم از طریق روشهای تخمیر کشت داد ۶- پروتئین های میکروبی اغلب نسبت به همتاهای جانوری و گیاهی خود پایدارترند. ۷-منابع قابل اعتمادی از مواد اولیه جهت رشد آنها به راحتی فراهم میشود. بطور کلی می توان گفت محدودیت تولید آنزیم های حیوانی و گیاهی از یک سو و تولید ناکافی این منابع برای پاسخ به در خواست جهانی تولید آنزیم و توجه را به سوی آنزیم های میکروبی معطوف کرده است (Kroner, 1984).
امروزه آنزیم ها در صنایع مختلف کاربردهای فراوانی دارند بطوریکه در سال ۲۰۰۰ بازاری معادل ۱.۵ بیلیون دلار آمریکا صرف خرید آنزیم برای استفاده در صنایع گوناگون شده است. از میان آنزیم ها آنزیم هایی که نقش هیدرولیز کننده دارند مانند پروتئازها، آمیلاز، استراز و لیپازها حائز بیشترین اهمیت می باشد. در این میان ۴۰٪ از سهم فروش سالیانه آنزیمی (معادل ۱۳۰۰-۱۵۰۰تن در سال) مربوط به پروتئازها می باشد. پروتئازها در صنایع گوناگون کاربرد دارند. بخش عمده ای از کاربرد آنها در شوینده ها به عنوان افزودنی و مابقی در صنایع غذایی، دارویی، چرم و تشخیص پزشکی استفاده می شود (Gupta, 2004). از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند که این آنزیم هم چنین با نام های سرالیزین و سراشیاپپتاز و سراشیو پپتیداز شناخته می شود. سراپپتیداز متالوپروتئاز حاوی روی خارج سلولی و شامل ۴۷۰ اسید آمینه و با جرم مولکولی۶۳۲۵۰ دالتون می باشد که توسط انتروباکتریوم سراشیا غیر پاتوژن E15 تولید می شود. این میکروارگانیسم در ابتدا در اواخر ۱۹۶۰ از روده کرم ابریشم جدا شد (Hase& Finkelstein , 1993).
این آنزیم به دلیل توانایی آن در درمان انسداد شریانی در بیماران مبتلا به بیماری عروق کرونر به عنوان آنزیم معجزه توصیف می شود (Raskin, 1999). سراپپتیداز دارای خواص ضد التهابی قوی و در درمان تورم پس از ضربه و بیماری های پستان فیبروسیس و برونشیت بسیار مفید است. کاهش درد از دیگر ویژگی های آن است که علت آن توانایی در جلوگیری از آزاد شدن آمین ها یا القاکننده درد از بافتهای ملتهب است (Mazzonie et al, 1990). بنابراین با توجه به مزایای فوق میتوان ازآن به عنوان یک آنزیم دارویی استفاده کرد.
۱-۲ بیان مسئله و ضرورت تحقیق
۱-۲-۱ آنزیم ها
موجودات زنده به لحاظ دارا بودن کاتالیزورهای زیستی که اصطلاحا آنزیم نامیده می شوند، قادر به کسب انرژی از محیط و مصرف سریع آن می باشند. همچنانکه در مورد کاتالیزورهای معدنی مشاهده می شود. آنزیم ها قادر به تسریع واکنش های شیمیایی بوده ولیکن در تعادل نهایی شرکت نمی کنند. برخلاف کاتالیزورهای معدنی، آنزیم هادارای دامنه عمل بسیار ظریفی هستند و در مقایسه، دامنه بسیار محدودی از مواد را کاتالیز می کنند و یا اینکه در بعضی موارد تنها یک واکنش را کاتالیز می کنند. آنزیم ها بنا به تعریف در شرایط خاصی از pH، درجه حرارت و غلظت سوبسترا بهینه فعالیت دارند و ممکن است به کوفاکتورهای ویژه ای نیاز داشته باشند.
آنزیم ها بر حسب نوع واکنشی که انجام می دهند به ۶ گروه اصلی تقسیم بندی می شوند:
اکسیدوردوکتازها
ترانسفرازها
هیدرولازها
لیازها
ایزومرازها
لیگازها
۱-۲-۲ غربالگری ((screening آنزیم ها و اهمیت آن
با غربالگری ارگانیسم ها به منظور فعالیت های بیوکاتالیزی مختلف، می توان محصولات تولید شده توسط آنها را که نسبت به وظایف خود در خلال فرایند تکامل سازش یافته اند به دست آورد.بنابراین غربالگری از جنبه های مختلف یک سرمایه گذاری مناسب محسوب می گردد (Dalboge& Dalboge,1998). غربالگری بیوکاتالیست های جدید با اهداف آکادمیک و علوم پایه و یا به منظورهای کاربردی-صنعتی صورت می گیرد (Xuyang et al, 1995). منابع تولید کننده آنزیم ها بسیار متعدد هستند. اما میکروارگانیسم ها بنا به دلایلی که به آنها اشاره خواهد شد مهمترین و عمده ترین منبع تولید کننده آنزیم ها هستند که مد نظر می باشند. فرآیند های اولیه در تحقیقات و به دست آوردن یک انتخاب[۱] و غربالگری[۲] محصول آنزیمی می باشند. جستجو به منظور یافتن یک ژن کد کننده ویژه برای آنزیم هدف، دارای اهمیت ویژه است. در گذشته این فرآیند منحصرا شامل غربالگری میکروارگانیسم های زنده بود. (غربالگری میکروبی کلاسیک). اما با بکار گیری روش های نوین بیولوژی مولکولی، غربالگری بدون نیاز به کشت ارگانیسم ها قابل انجام می باشد (Richardson et al, 2002 ). البته هر روشی دارای محدودیت هایی است و ترکیبی از تکنیک ها (combinational screening) اغلب بسیار موفقیت آمیز است (Aehle, 2004). برای شروع فرآیند جستجو و کشف، تنوع عظیم از میکروارگانیسم ها در طبیعت بهترین مژدگانی است (Kristjansson&Gudmundur, 1995).
تنوع متابولیکی به وجود آمده در ۸۵% از تاریخ زمین که حیات محدود به میکرو ارگانیسم ها است واقعا شگفت انگیز است. در غربالگری جمع آوری نمونه ها از منابع طبیعی می تواند بدون هیچ تمایزی صورت گیرند (مثل نمونه های خاک) یا شرایط اکولوژیک در این بررسی مورد توجه قرار گیرد و یک جستجوی هدفدار از یک زیستگاه خاص و ویژه که احتمال یافتن یک فعالیت آنزیمی یا یک خصوصیت آنزیمی ویژه در آن وجود دارد انجام شود. در صورتیکه منابع مورد جستجو و کاوش قبلا کمتر مورد بررسی قرار گرفته باشند و یا جدیدا کشف شده باشند، احتمال دستیابی به تنوع بیشتر ژنومی و استخراج میکروب های جدید (novel) بسیار افزایش می یابد. در کنار موارد فوق راهکارهایی که بر اساس تاکسونومی می باشد و شامل بررسی سیستماتیک از ارگانیزم های شناخته شده است نیز می تواند موفقیت آمیز باشد. امروزه غربالگری با تکنیک های جدید نظیر تکامل جهت یافته[۳]دستیابی به فعالیت های جدید، خصوصیات جدید و بهبود بیوکاتالیست ها از جنبه های مختلف، همچنین پی بردن به مکانیسم های دخیل در آنها شتاب بیشتری گرفته است (Ashie , 2003) و (Bronscheuer& Pohl, 2001 ).
۱-۲-۳ منابع آنزیمی
۱-۲-۳-۱ میکروارگانیزم ها به عنوان عمده ترین منابع آنزیمی
منابع تولید آنزیمها بسیار متنوع است. میکروارگانیزم ها به عنوان عمده ترین و مهمترین منبع تولید آنزیمها محسوب می گردند. در صنعت منابع جانوری و گیاهی به ترتیب تنها %۸ و %۳ از کل آنزیمها را شامل می شوند و سایر آنزیم های مورد استفاده منشأ میکروبی دارند (Horikoshi, 1995). بنابه دلایل زیر میکروبها به عنوان منابع آنزیمی نسبت به گیاهان و جانوران ترجیح داده می شوند:۱- برای تولید عموما ارزانند، ۲- آنزیمهای موجود در آنها بیشتر قابل پیش بینی و کنترل هستند، ۳- بافتهای گیاهی و جانوری مواد مضر بیشتری دارند (مانند ترکیبات فنلی در گیاهان، مهارکننده های داخل سلولی و پروتئازها)، ۴- نسبت به گیاهان و جانوران راحت تر می توان میکروب ها را از نظر ژنتیکی دستکاری نمود، ۵- میکروارگانیزم ها را می توان در مقادیر بالا و در یک مدت زمان نسبتا کم از طریق روشهای تخمیر کشت داد. ۶- پروتئین های میکروبی اغلب نسبت به همتاهای جانوری و گیاهی خود پایدارترند (Waites et al 2001).
با پیدایش تکنولوژی DNA نوترکیب و نیازهای جدید، میکروارگانیسم ها به عنوان منابع آنزیمی حتی اهمیت بیشتری یافته اند. جستجو و یافتن بیوکاتالیست ها، هم با اهداف آکادمیک و هم با جنبه ها و اهداف کاربردی صورت می گیرد. در هر دو حالت میکروارگانیسم ها ارجحیت دارند. این امر اگر با اهداف آکادمیک صورت گیرد محقق اغلب از دامنه وسیعی از منابع، انتخاب را انجام می دهد. این میکرو ارگانیسمها متعلق به هر سه حوزه Eukaryotes , Bacteria , Archaea می باشند.
۱-۲-۳-۲ موقعیت تاکسونومیک تولید کننده های شناخته شده آنزیمی
جالب است که اغلب آنزیمهای میکروبی قابل تجاری شدن در تعداد معدودی از جنس های قارچی و باکتریایی یافت می شوند و در نقاط خاصی از موقعیت های تاکسونومیک تجمع یافته اند. شناخته شده ترین آنها عمدتا متعلق به گونه هاب باکتریاییBacillus وPseudomonas و قارچهای Ascomycete شامل جنس هایTricoderma,Fusarium ,Aspergillusهستند. بعلاوه گونه های متعلق به Rhizomucor Homicolarو Mucor تولید کننده برخی از آنزیم های صنعتی می باشند.
۱-۲-۳-۳ میکروارگانیسم هایGRAS
اغلب پروتئین ها و آنزیمهای صنعتی مهم توسط تعداد معدودی از ارگانیسم ها که جزءGRAS
(generally recognized as safe) دسته بندی می گردند، تولید می شوند. میکروارگانیسمهای GRAS شامل باکتری هایی نظیر Bacillus amyloliquefaciensBacillus subtilis به علاوه سایر گونه های متعلق به bacilli, lactobacilli وstreptomyces می باشند.
قارچ های GRAS شامل اعضای گونه های جنس Aspergillus, Penicillum, MucorوRhizopus هستند. مخمرها نظیر Saccharomyces cerevisae نیز GRAS می باشند. میکروبهای GRASغیر بیماریزا و غیر سمی می باشندو نباید آنتی بیوتیک تولید نمایند (Kenddd& Cabral , 1987) و (Waites et al , 2001).

دانلود متن کامل این پایان نامه در سایت abisho.ir