علمی : کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- قسمت …

۱-۲-۴ کلکسیونهای میکروب (Culture Collection)به عنوان منابع میکروارگانیسمها
میکروارگانیسمها را می توان از طریق غربالگری یا کلکسیون سویه ها به دست آورد. این کلکسیون ها در بسیاری از آزمایشگاه های مرتبط با تکنولوژی آنزیمی جمع آوری و تهیه شده اند. به علاوه در بسیاری از کشورها کلکسیون های ملی زیر نظر دولت ایجاد شده اند. تقریبا ۵۰۰ کلکسیون میکروبی در سراسر دنیا وجود دارد. این کلکسیون ها سرویس هایی را در اختیار سازمانهای صنعتی و یا آکادمیک قرار می دهند. سویه ها عموما به صورت لیوفیلیزه نگهداری می شوند و در کنار آن c-DNA یا DNA ژنومی نیز در برخی موارد موجود می باشد (Waites et al , 2001).
با وجود تکنولوژی DNA نوترکیب و روشهای مبتنی بر مهندسی ژنتیک، جستجوی میکروارگانیسم های جدید یا فعالیت آنزیمی جدید هنوز هم بسیار حائز اهمیت است.
میکروارگانیسم ها یک راه حل عملی را برای بهبود فعالیت های آنزیمی پیش رو قرا می دهند. در حال حاضر، عقیده بر این است که برای تولید هر نوع محصول هدف یک میکروارگانیسم یا کاتالیست آنزیمی مشتق شده از یک میکرو ارگانیسم میتوان از طبیعت بدست آورد. اگر چه میکروارگانیسم ها با چشم غیر مسلح دیده نمی شوند اما بیوسفر را تحت سلطه خود دارند. به عنوان مثال تخمین زده می شود که یک گرم خاک می تواند بالغ بر ۴۰۰۰ گونه باکتریایی مختلف داشته باشد (Torsvik et al, 1990). در حال حاضر تخمین ها برای تعداد کل گونه های میکروبی روی زمین بین یک میلیون تا یکصد میلیون می باشد اما تنها حدود ۵۰۰۰ گونه میکروبی در منابع علمی آورده شده است (Short, 1997). از طرف دیگر روشهای مهندسی ژنتیک با وجود تمام پیشرفت هایش با چالش هایی روبروست:
۱- تاخوردگی ناصحیح پروتئین، ۲- عدم گلیکوزیلاسیون پروتئین های یوکاریوتی در باکتری ها، ۳- حذف نشدن متیونین انتهای آمین .گرچه مهندسی ژنتیک قادر به ایجاد آنزیمهای جدید یا بهبود یافته می باشد، طراحی ژنهای جدید که توانایی های جدیدی کد می نمایند و طراحی، شناخت و بهبود خصوصیات آنزیمی از جنبه های فعالیت و پایداری بسیار مشکل می باشد زیرا اطلاعات در دسترس و دانش ما در ارتباط با اساس مولکولی آنها ناچیز است. بنابراین یافتن منابع جدید و غربالگری ارگانیسم ها به منظور جداسازی بیوکاتالیستهای جدید بسیار مهم بوده وبه عنوان یک روش اصلی در یافتن آنزیمهای جدید باقی مانده است (Wahler& Reymond, 2001) و (Horikoshi, 1995).
۱-۲- ۵ بازار جهانی آنزیم
بازار آنزیم موقعیتی مرکزی در اقتصاد جهانی پیدا کرده است بطوریکه تولید تجاری آنزیم یکی از پر سود ترین بازارهاست. در سال ۱۹۸۷، بازار جهانی آنزیم ، ۴۵۰ میلیون دلار آمریکا و در سال ۲۰۰۸، حدود ۳ میلیون دلار آمریکا و در دهه ی اخیر رشد متوسط سالیانه، ۹درصد بوده است.در این میان سه دسته آنزیم شناسایی شده است:

  1. آنزیم های صنعتی (آمیلازها، پروتئازها، کاتالازها، ایزومرازها، لیپازها، سلولازها و …)
  2. آنزیم های مورد استفاده در تشخیص طبی ( گلوکز اکسیداز، الکل دهیدروژناز، هگزوکیناز، کلسترول اسیلاز و غیره)
  3. آنزیم های مورد استفاده در داروسازی ( آسپاراژیناز، پروتئاز، لیپاز، استرپتوکیناز و غیره) (Crueger& Crueger, 1990).

۱-۲-۶ پروتئاز ها
تاریخچه
حدود ۳۰ سال قبل پروتئازها را به عنوان آنزیم های تجزیه کننده ای معرفی کردند که فقط می توانند هیدرولیز کلی پروتئین ها را انجام دهند. پیشرفت های اخیر در روش های اندازه گیری و استفاده از سوبسترا های اختصاصی مشخص کرده است که آنزیم های هیدرولیز کننده پروتئین تغییرات انتخابی و خیلی اختصاصی را در پروتئینها با هیدرولیز محدود انجام می دهند. بعلاوه پروتئازها نقش مهمی را در آزمایشگاه و کلینیک و همچنین در فرآیند های صنعتی ایفا می کنند.
پروتئازها از دهه ۱۹۶۰ به عنوان مواد افزودنی به شوینده ها مطرح شدند و استفاده تجارتی از آنها به سرعت توسعه پیدا کرد. به عنوان مهمترین آنزیم های صنعتی، پروتئاز ها حدود ۶۰ درصد کل تجارت آنزیم ها را شامل می شوند که دو سوم پروتئاز های تجاری تولید شده منشا میکروبی دارند.
از مهمترین پروتئازهای میکروبی که به صورت تجاری موجود می باشند، پروتئازهای قلیایی حاصل از
Bacillus licheniformis هستند که در تولید شوینده ها استفاده می شوند، پروتئازهای حاصل از Mucor که در تولید پنیر کاربرد دارند و پروتئازهای حاصل از Aspergillus oryzae که در تغییر خمیر نان و تولید سس سویا استفاده می شوند، اهمیت دارند. این پروتئاز ها به عنوان مهمترین آنزیم های دارای تولید بالا در جهان مطرح می باشند. به هر حال، پروتئاز های دیگر ی نیز در فرآیندهای مختلفی بخصوص در صنایع غذایی نقش دارند و بکار می روند که در بین آنها پروتئاز های قارچی اهمیت خاصی دارند.
۱-۲-۶-۱ اعمال پروتئازها
خصوصیات کلی:
دارای خصوصیات فیزیکی و شیمیایی و کاتالیتیکی متفاوتند.
نقش در فرآیند متابولیکی و تنظیمی درارگانیسم های پروکاریوت و یوکاریوت دارند.
.پروتئازهای خارج سلولی با تجزیه سوبستراهای پلی پپتیدی بزرگ به مولکولهای کوچک باعث تامین پپتید ها و اسید آمینه های ضروری برای رشد میکروارگانیسم ها می شوند.
پروتئاز های داخل سلولی نقش کلیدی در تنظیم فرآیندهای متابولیکی و همچنین نقش حیاتی در بازیابی پروتئین دارند که تعادل بین سنتز و تخریب پروتئین را حفظ می کند.
در کنترل بسیاری از اعمال فیزیولوژیکی از جمله هضم مواد، تغییرات هورمونی، تجمع پروتئین های ویروسی، پاسخ ایمنی بدن، التهاب، باروری، انعقاد خون، از بین بردن لخته خون، کنترل فشار خون، بازیابی دیواره سلولی در باکتری ها، تشکیل اسپور در باکتری، تندش اسپور، جدا شدن کنیدی از کنیدیوفور در قارچ ها و بیماری زایی نقش دارند. پروتئازها همچنین در تنظیم بیان ژن ها، ترمیم DNA و سنتز DNA نقش دارند (Kalisz, 1988).
منابع تولید کننده پروتئاز
گیاهان: گیاهان پروتئازهای متعددی با خواص فیزیکوشیمیایی متفاوت تولید می کنند. از میان پروتئازهایی که توسط گیاهان تولید می شوند و بیشترین اهمیت را در بین آنها دارند، می توان به پروتئازهای پاپائین، برومولین و کراتیناز اشاره نمود. مشکل اصلی در تولید پروتئازهای گیاهی احتیاج به زمان زیاد در روند تولید می باشد که کاربرد آنها را محدود نموده است.
پاپائین: یک سیستئین پروتئازی است که از شیره خام میوه گیاه Papayacarica که درمناطق استوایی میروید استخراج می شود. این پروتئاز گیاهی در محدوده pH بین ۵ تا ۹ مقاوم است و تا دمای ۸۰ یا ۹۰ در حضور سوبسترا پایدار استو کاربرد وسیع در صنایع غذایی برای تهیه پروتئین هیدرولیز شده دارد.
برومولین: نوعی سیستئین پروتئاز می باشد که از ساقه و آب آناناس تهیه می شود.(از ریشه و آب آناناس) و در محدوده pH بین ۵ تا ۹ فعال است و در دمای C°۷۰ غیر فعال می شود.
کراتیناز: پروتئاز گیاهی می باشد که در هضم آنزیمی پشم و مو به منظور تولید اسید آمینه ضروری لیزین و کمک به سیستم هضم فاضلاب کاربرد دارد.
جانوران:
پروتئازهای تولید شده توسط سلولهای حیوانی در صنعت کاربردهای وسیعی دارند. از جمله مهمترین آنزیم های کاربردی در صنعت می توان به مواردی همچون تریپسین، کیموتریپسین، پپسین و رنین اشاره نمود.
Trypsin: تریپسین آنزیم اصلی دستگاه گوارش است که مسئول هیدرولیز پروتئین های غذا است. نوعی سرین پروتئاز با وزن مولکولی ۲۳ کیلودالتون می باشد و در کنترل بیولوژیک آفات حشرات، تولید هیدرولیزات پروتئینی و در تهیه ی محیط کشت میکروبی و بعضی کاربردهای تخصصی پزشکی استفاده می شود.
Chymotrypsin: آنزیم کیموتریپسیناز پانکراس در روده ترشح می شود.pH مناسب برای فعالیت آن ۸ می باشد. این آنزیم تنها پیوندهای پپتیدی را مورد حمله قرار می دهد که گروه های کربوکسیل در آنها از اسید آمینه تیروزین یا فنیل آلانین و یا تریپتوفان تامین شده باشد. دارای وزن مولکولی ۲۳ کیلو دالتون می باشد که استفاده در تشخیص پزشکی دارد.
Pepsin: پپسین پروتئاز اسیدی از نوع آسپارتیل پروتئاز می باشد. فعالیت بهینه بین pH 1 و ۲ است و در pH بالاتر از ۶ غیر فعال می شود و وزن مولکولی ۳۴ کیلودالتون دارد.
Renin: آنزیمی با وزن مولکولی ۳۰ کیلودالتون می باشد که در صنایع لبنی به هنگام تهیه ماست و پنیر مورد استفاده قرار می گیرد (Rao et al, 1998).
آنزیم های میکروبی
میکروارگانیسم های تولید کننده پروتئاز، به دلایلی همچون قابلیت کشت در سطحی وسیع، تولید آنزیم در مقیاس بالا و داشتن نیمه عمری بیشتر نسبت به سایر پروتئازها اهمیت خاص دارند. اغلب این آنزیم ها را می توان هفته ها بدون تغییر آشکار در فعالیت آنزیمی نگهداری نمود. در ضمن به دلیل تولید آنزیم خارج سلولی، بر خلاف پروتئازهای حیوانی و گیاهی که باعث سهولت روند مراحل عملیات پایین دستی[۴] و مراحل خالص سازی آنزیم می شود، هدف اصلی در مطالعات علمی برای کاربرد در صنعت قرار دارند (Kumar& Takagi, 1999).
باکتری ها
پروتئازهای باکتریایی یکی از بزرگترین کلاس آنزیم های صنعتی می باشد که در حدود ۴۰% از کل فروش آنزیم ها در سراسر جهان به شمار می روند. ناتوانی پروتئازهای گیاهی و جانوری در از بین بردن مطالبات جهانی استفاده از آنزیم ها، باعث توجه ویژه به پروتئازهای میکروبی شده است (Claudia et al 1993) و (Rao et al, 1998). در صنعت منابع گیاهی و جانوری برای تولید آنزیم به ترتیب مقادیر ۸% و۴% از کل آنزیمها را شامل می شوند و سایر آنزیمهای استفاده شده منشأ میکروبی دارند (Bronscheuer& Pohl, 2001). منابع میکروبی به دلیل ویژگی های زیر به منابع گیاهی و حیوانی ترجیح داده می شوند.

دانلود کامل پایان نامه در سایت pifo.ir موجود است.