کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- …

دارای تنوع بیوشیمیایی گسترده ای هستند.
برای تولید ارزان هستند.
دارای قابلیت بهتر در دستکاری ژنتیکی برای تولید آنزیم های جدید به منظور کاربرد های مختلف می باشند.
مواد مضری که ممکن است فعالیت آنزیم را کاهش دهد یا تخریب کند در گیاهان و جانوران بیشتر است.
میکروارگانیسم ها دارای رشد سریع و. نیاز به فضای محدود برای کشت سلول می باشد.
پایداری پروتئین های میکروبی نسبت به همتاهای گیاهی وجانوری خود بیشتراست (Waites et al, 2001) و (Chaplin& Bucke, 1990).
قارچ ها
از دیگر منابع اصلی تولید کننده پروتئازها می توان قارچ ها را نام برد. قارچ ها نسبت به باکتری ها، پروتئازهای متنوع تری را تولید می کنند که در محدوده pH وسیع ۴ تا ۱۱ فعال هستند. در ضمن دامنه هضم سوبسترایی وسیع تری نسبت به پروتئازهای باکتری ها دارند. با وجود تمامی مزیت های مذکور، پروتئاز های قارچی به دلیل فعالیت پایین آنزیم و عدم پایداری در برابر حرارت کمتر از پروتئازهای باکتریایی در صنعت استفاده می شوند. در میان قارچ های تولید کننده پروتئاز، آسپرژیلوس ها بالاترین میزان پروتئاز را تولید می کنند و از لحاظ تجاری حائز اهمیت هستند. از پروتئازهای قارچی به دلیل فعالیت بهینه در pH های اسیدی بین ۴ تا ۵/۴ و پایداری و فعالیت در pH بین۵/۲تا ۶، در صنایع غذایی به منظور لخته نمودن شیر و تخمیر پنیر استفاده می شود.
ویروس ها
ویروس ها پروتئازهای متعددی را برای پردازش پروتئین های کپسیدی و آنزیم های پلیمرازی تولید می نمایند. دانشمندان توانسته اند از پروتئازهای ویروسی علیه پروتئین های ویروسی ایجاد کننده بیماری های مهلک همچون سرطان و AIDS استفاده نمایند. ویروس ها انواع پروتئازها شامل سرین پروتئازها، آسپارتیک پروتئازها و سیستئین پپتیدازها را تولید می نمایند ولی تا به حال هیچ متالوپروتئازهای در بین پروتئازهای ویروسی مشاهده نشده است (Lu et al, 1969).
۱-۲-۶-۲ دسته بندی پروتئازها
راه های گوناگونی برای طبقه بندی پروتئاز ها وجود دارد اما به طور کلی پروتئازها را بر اساس سه اصل اساسی زیر طبقه بندی می کنند.
الف) نوع واکنشی که کاتالیز می نمایند ب) طبیعت شیمیایی جایگاه فعال آنزیم ج) ارتباطات تکاملی بر اساس ساختار آنزیم.
در مجموع پروتئازها با توجه به محل اثرشان به دو گروه اگزوپپتیداز و آندوپپتیداز دسته بندی می شوند و هر کدام را نیز با توجه به جایگاه فعالشان به زیرگروه هایی تقسیم می نمایند.
اگزوپپتیداز ها
این گروه از پروتئازها در یکی از دو انتهای کربوکسیل یا آمینی پروتئین عمل می نمایند و بر همین اساس نیز به دو گروه آمینوپپتیداز و کربوکسی پپتیداز دسته بندی می شوند.
آمینوپپتیدازها
این دسته از پروتئازها، اسیدهای آمینه را به شکل تک تک، دوتایی و یا سه تایی از انتهای آمینی پروتئین آزاد می سازند. آمینو پپتیدازها توسط گستره وسیعی از میکروارگانسیم ها شامل باکتری ها و قارچ ها تولید می شوند. به طور کلی آمینوپپتیدازها، آنزیم های داخل سلولی می باشند و در آسپرژیلوس اوریزه نوع خارج سلولی آن نیز گزارش شده است (Labbe et al, 1974).
کربوکسی پپتیدازها
این دسته از پروتئازها اسیدهای آمینه را به صورت تک تک یا دو تایی از انتهای کربوکسیل پروتئین آزاد می نمایند و بر اساس جایگاه فعال آنزیمی به سه گروه سرین کربوکسی پپتیداز، متالوکربوکسی پپتیداز و سیستئین کربوکسی پپتیداز تقسیم می شوند.
اندوپپتیدازها
این دسته از پروتئازها در جایگاه های داخل پلی پپتید عمل می نمایند و بر اساس اسید آمینه موجود در جایگاه فعالشان به چهار دسته تقسیم می شوند.
۱٫سرین پروتئازها

  1. سیستئین پروتئازها
  2. آسپارتیک پروتئازها

۴ . متالوپروتئازها
سرین پروتئازها
این گروه از پروتئازها در تعداد کثیری از ارگانیسم ها از قبیل ویروس ها، باکتری ها و یوکاریوت ها مشاهده شده است و جزء آنزیم های حیاتی برای ارگانیسم ها می باشند. سرین پروتئاز به اشکال گوناگون اگزوپپتیداز، الیگوپپتیداز و امگا پپتیدازی در ارگانیسم های مختلف مورد بررسی قرار گرفته است. این آنزیم ها در ناحیه فعال خود یک سرین دارند و عموما” بوسیله DFP(Diisopropyl fluorophosphates) یا Phenylmethylsulphonyl fluoride) PMSF ) مهار می شوند. به طور کلی به چند گروه اصلی تقسیم می شوند که شامل کیموتریپس(SA)، سابتیلیزین(SB)، کربوکسی پپتیداز C(SC)، D-Ala-D-Ala پپتیدازA در اشرشیاکلی (SE) و مهار کنندهLex A (SF) می باشند (S=Subtilisin). در سه گروه اول یعنی SA، SB، SC توالی همسان سه تایی (Triad) شامل اسید های آمینه سرین (نوکلئوفیل)، آسپارتیک اسید (الکتروفیل) و هیستیدین در جایگاه فعال قرار می گیرد. نکته دیگر حائز اهمیت، حضور مناطق کاملا محافظت شده اسیدآمینه گلایسین (GLY) در کنار توالی همسان سه تایی می باشد که تشکیل موتیف (GLY-Xaa-Ser-Yaa-Gly) را داده است (Shimogaki et al, 1991).
سرین پروتئازها عموما” در pH خنثی یا قلیایی فعال هستند و فعالیت بهینه آنها در pH بین ۷ تا ۱۱ می باشد. آنها دارای اختصاصیت وسیعی در سوبسترا بوده و از آن جمله فعالیت استرولیتیک قابل ملاحظه ای در برابر سوبستراهای استری دارند. وزن مولکولی آنها معمولا” کم (۵/۱۸ تا ۳۵ کیلودالتون) است ولی بزرگترین سرین پروتئاز گزارش شده در میکروارگانیسمها پروتئاز موجود در Blakeslea trispora با وزن مولکولی ۱۲۶ کیلودالتون بوده است. بیشتر آنها نقطه ایزوالکتریک بین ۴/۴ تا ۲/۶ دارند (Kalisz, 1988).
سیستئین پروتئازها
این دسته از پروتئازها در پروکاریوت ها و یوکاریوت ها تولید می شوند و فعالیت پروتئولیتیک آنها به جایگاه دوگانه حاوی سیستئین و هیستیدین بستگی دارد. عامل اصلی تمایز در این دسته آنزیم ها ترتیبcys-his، His-cys می باشد که باعث تفاوت در عملکرد آنها می شود (Gupta et al,2002). سیستئین پروتئازها نسبت به محلولهای سولفیدریل مانند pCMB، TLCK، اسید ایدواستیک، ایدواستامید و فلزهای سنگین حساس بوده و در حضور محلولهای احیاکننده مانند سیانید پتلسیم یا سیستئین و EDTA فعال می شوند. بیشتر این آنزیم ها در pH بین ۵ تا ۸ فعال بوده و بعضی از آنها بوسیله مواد احیاکننده تحریک می شوند (Kalisz, 1988). پپتیداز گیاهی پاپائین شناخته شده ترین سیستئین پروتئاز می باشد در سیستئین پروتئازها یک مجموعه کاتالیک سه تایی سیستئین-هیستیدین-آسپارتات وجود دارد که در واقع آنالوگ سرین-هیستیدین-آسپارتات در سرین پروتئازها است.
آسپارتیک پروتئازها
بیشتر آسپارتیک پروتئازها به خانواده پپسین تعلق دارند. خانواده دیگری که در این گروه قرار می گیرد پروتئازهای ویروسی مانند رتروپپسین[۵] (پروتئاز ویروس ایدز) هستند. آسپارتیک پروتئازها برای فعالیت کاتالیک احتیاج به گروه آسپارتیک اسید دارند. مطالعات کریستالوگرافی نشان داده است که این آنزیم به صورت دو قطعه ای (دو لوبی[۶]) است که سایت فعال بین دو لوب همولوگ قرار می گیرد. هر لوب یک گروه آسپارتات را ارائه می دهد. این دو باقیمانده آسپارتیل در مولکول فعال در فضا کاملا در نزدیکی هم قرار دارند و یکی از آنها یونیزه شده در حالیکه دیگری یونیزه نشده است.در این بین رتروپپسین دارای یک ریشه آسپارتات (مونومریک) است که برای فعال شدن آنزیم باید دیمریزه شدن صورت گیرد. در کاتالیز با آسپارتیک پروتئازها برخلاف سایر گروه های پروتئازها (سرین و سیستئین پروتئازها) شکل گیری واسطه ای با پیوند کووالانسی (آنزیم- سوبسترا) دیده نمی شود و حمله نوکلئوفیلی با انتقال همزمان دو پروتون صورت می گیرد(Horikoshi, 1999).
آسپارتیک پروتئازها به وسیله فعالیت حداکثر در pH پایین (۳ تا ۴) و عدم حساسیت به مهارکننده های سه گروه دیگر آنزیم ها شناخته می شوند. بیشتراسپارتیک پروتئازها به ترکیبات اپوکسی کتون و دی آزوکتون در حضور کاتیون های مس حساسند. بیشتر اسپارتیک پروتئازها دارای وزن مولکولی بین ۳۰ تا ۴۵ کیلودالتون بوده و نقطه ایزوالکتریک آنها معمولا” بین ۴/۳ تا ۶/۴ می باشد.
متالوپروتئازها
متالوپروتئازها متنوع ترین گروه پروتئازها و شامل آنزیم هایی مانند کلاژناز، هموراژیک توکسین[۷]و ترمولیزین باکتریایی هستند تمام متالوپروتئازهای گزارش شده دارای pH بهینه بین ۵ تا ۹ بوده و این آنزیم ها به حضور کاتیون دو ظرفیتی وابسته هستند بنابراین نسبت به محلولهای Chelat کننده فلز مانند EDTA حساس می باشند ولی تحت تاثیر مهارکننده های سرین پروتئازها یا محلول های سولفیدریل قرار نمی گیرندو تعدادی از آنزیم های مهار شده بوسیله EDTA، در حضور یون هایی مانند روی، کلسیم و کبالت دوباره فعال می شوند.متالوپروتئازها فراوان بوده ولی فقط در تعداد کمی از قارچ ها گزارش شده اند. بیشتر متالوپروتئاز های باکتریایی و قارچی حاوی روی می باشند که به ازای هر مولکول آنزیم یک اتم روی گزارش شده است. اتم روی برای فعالیت آنزیم ضروری می باشد و کلسیم برای پایدار کردن ساختمان پروتئین لازم است. بیشتر متالوپروتئازها دارای موتیف His-Glu-Xaa-Xaa-His هستند که بخش اتصال یون فلزی (معمولا Zn) را تشکیل می دهد (Kalisz, 1988) و (Horikoshi, 1999).
۱-۲-۷ کاربرد پروتئاز ها
امروزه پروتئازهای میکروبی تقریباً ۴۰ درصد از فروش سالیانه آنزیمی در صنایع گوناگون از قبیل شوینده ها، صنایع غذایی، دارویی، چرم، تولید پروتئین های هیدرولیز شده، صنایع فیلم و مدیریت بازیافت ضایعات را به خود اختصاص داده اند. پروتئازهایی که در صنایع غذایی و شوینده کاربرد دارند، در مقادیر زیاد تهیه می شوند و به صورت خام (Crud) تولید می شوند. در حالیکه پروتئازهایی که در صنایع دارویی مورد استفاده قرار می گیرند در مقادیر کم تولید شده، اما قبل از اینکه مورد استفاده قرار گیرند به تخلیص فراوان نیاز دارند (Rao et al, 1998) و (Godfrey& West, 1996).

برای دانلود متن کامل این فایل به سایت torsa.ir مراجعه نمایید.