مقاله – کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- قسمت …

۱-۲-۷-۱ صنعت شوینده
مهمترین کاربرد پروتئازهای قلیایی در صنعت، استفاده در پودرهای ماشین رختشویی و ظرفشویی به عنوان افزودنی در فرمولاسیون شوینده ها می باشد. بطوریکه ۳۰ درصد از بازار فروش آنزیم های صنعتی را به خود اختصاص داده است.
تاریخچه کاربرد پروتئازها در شوینده ها به سال ۱۹۱۴ باز می گردد که برای اولین بار، شوینده حاوی پروتئاز به نام Burnus توسط دانشمندان آلمانی Rohm, Hassساخته شد. پروتئاز به کار رفته در پودر این شوینده حاوی عصاره پانکراس و کربنات سدیم بود.
اولین دترجنت حاوی آنزیم میکروبی نیز در سال ۱۹۵۶ با نام تجاری Bio-40 به بازار عرضه شد. در سال ۱۹۶۰ شرکت Novo، آنزیم آلکالاز که پروتئاز ترشحی باکتری B.licheniformis بود را با نام تجاری Biotex به بازار عرضه نمود و در پی این روند پروتئازهای صنعتی متعددی به بازار تجاری معرفی شدند.
عوامل اصلی گزینش پروتئازها برای استفاده در فرمولاسیون پودرهای شوینده ها شامل توانایی آنزیم در هضم نمودن محدوده وسیعی از سوبستراها است که مربوط به رنگ، مواد غذایی، خون و ترشحات بدن می باشند، پایداری و بقا آنزیم در pH و دمای بالا، سازگاری با عوامل اکسیدکننده موجود در فرمولاسیون شوینده ها، عوامل Chelate کننده یونهای موجود در شوینده ها و در ضمن داشتن نیمه عمر بالا و فعالیت در حداقل بین ۴/۰ تا ۸/۰ درصد نسبت به کل مواد موجود در شوینده ها می باشد.
اما عامل کلیدی در انتخاب پروتئازها، pH نقطه ایزوالکتریک (pI) می باشد، که بایستی نزدیک به pI حاصل از ترکیبات به کار رفته در فرمولاسیون پودرهای شوینده مورد استفاده در ماشین رختشویی و ظرفشویی باشد. آنزیم های Savinase, Esperase از باسیلوس های قلیا دوست که محصول شرکت Novo Industry هستند، pI=11 دارند که باعث پایداری آنها در محدوده وسیعی از pH قلیایی می شود.
استفاده از آنزیم های هیدرولیزکننده در شوینده ها باعث کوتاه نمودن زمان agitation و کاهش دمای شستشو در حین عملکرد ماشینهای رختشویی می شود.در ضمن نتایج آزمایشات نشان داده که استفاده همزمان از ترکیبی از چند آنزیم هیدرولیزی مانند لیپاز، آمیلاز و سلولاز همراه با پروتئاز باعث بهینه نمودن عملکرد پروتئاز در پودرهای رختشویی می شود(Rao et al, 1998) و (Samal et al, 1990) و (Phadatare et al, 1993) و (Gupta et al,2002) و (Nielsen et al, 1981) و (Horikoshi, 1999).
۱-۲-۷-۲ صنعت چرم
مراحل تهیه چرم شامل خیساندن، موزدایی، نرم کردن پوست و دباغی می باشد. از آنجائیکه جنس پوست و مو پروتئینی است، پروتئازها نقش مفیدی در رفع مشکلات چرم سازی ایفا می نمایند. در زمان گذشته در روند تهیه چرم، از مواد شیمیایی مضر از قبیل سولفات سدیم استفاده می نمودند که به دلیل آلودگی و انتشار آن، بسیار خطرناک می باشد در صورتیکه اخیرا از پروتئازها که به طور اختصاصی ترکیبات غیر کلاژنی و پروتئین های غیر فیبریلی مانند آلبومین و گلوبین ها را تجزیه می نمایند و ضرری برای جنس چرم ندارند استفاده می شود که نتیجه آن هضم اختصاصی ترکیبات اضافی می باشد. پروتئازهای قلیایی میکروبی برای جذب سریعتر آب و کاهش زمان موردنیاز برای خیساندن پوست، همچنین همراه با آهک آبدار و سدیم کلراید به منظور موزدایی استفاده می شوند. تریپسین را همراه با پروتئازهای باسیلوسی و آسپرژیلوس برای جلا دادن به کار می برند (Neklyudov et al, 2000).
۱-۲-۷-۳ صنایع دارویی
تاثیر انواع پروتئازها با اختصاصیت های گوناگون به عنوان عوامل درمانی بسیار مفید بوده است. تجویز خوراکی پروتئین هایی از آسپرژیلوس اوریزا به عنوان کمک کننده هضمی برای بهبود سندرم های کمبود هضم آنزیمی معین استفاده شده است. آنزیم ها معمولا با آنتی بیوتیک ها ترکیب می شوند و به عنوان پماد یا ژل یا به صورت یک پانسمان مرطوب و خشک به کار می روند. کلاژناز کلستریدیال یا سوبتیلیزین (سابتیلیزین) به صورت ترکیبی با آنتی بیوتیک های مختلف برای درمان سوختگی ها و زخم ها استفاده می شود. از آسپارژیناز جدا شده از E.coliبرای حذف آسپارژین از جریان خون در اشکال مختلفی از لوکمی های لنفوسیتیک استفاده می شود. اخیرا سیستئین پروتئازها، بویژه کاتپسین های لیزوزومی مورد توجه صنعت داروسازی قرار گرفته اند. کاتپسین های لیزوزومی مسئول فرآیندهای فیزیولوژیکی شامل تجزیه پروتئین سلولی می باشند. کاتپسین ها اهداف دارویی بسیاری از بیماری ها مانند Osteoporosis، آرتریت روماتوئید، Arterio sclerosis، تصلب شرائین، سرطان و بیماری های التهابی و اتوایمیون هستند (Rao et al, 1998).
۱-۲-۷-۴ صنایع غذایی
تاریخچه استفاده از پروتئازها در صنایع غذایی، به زمان بسیار قدیم باز میگردد که پروتئازهای میکروبی در تهیه پنیر، نان، فراوری گوشت، تهیه محصولات سویا، پروتئین های هیدرولیز شده و … استفاده میشد.
صنایع لبنی: مهمترین کاربرد پروتئازها در صنایع لبنیبه هنگام تهیه پنیر می باشد. آنزیم های مورد استفاده در لخته نمودن شیر به سه دسته رنین های حیوانی، پروتئازهای میکروبی و کیموزین های تولیدی توسط روش های مهندسی ژنتیک، تقسیم می شوند که دو گروه اول جزء دسته آسپارتیک پروتئازهای اسیدی با وزن مولکولی ۳۰ تا ۴۵ کیلودالتون می باشند. برای اولین بار در سال ۱۹۹۸، کیموزین های تولیدی از طریق تکنیک DNA نوترکیب برای استفاده در صنایع تولید پنیر مورد ارزیابی قرار گرفتند و به تدریج جایگاه اصلی را در پنیرسازی به خود اختصاص دادند به طوریکه شرکت Genencor، تولید آنزیم نوترکیب قارچ آسپرژیلوس نایجر، واریته awamori را به سطح تجاری رساند و هم اکنون نیز سه نوع کیموزین نوترکیب در تهیه پنیر استفاده می شوند.
صنایع نانمشکل اصلی در تهیه نان، آرد گندم است زیرا که متشکل از پروتئین نامحلول گلوتن می باشد که این امر مشکلات فراوانی را در تهیه نان ایجاد می کند. با تیمار نمودن گلوتن توسط اگزو آندو پروتئازهای قارچ آسپرژیلوس اوریزه می توان این مشکل را رفع نمود (Rao et al, 1998) و (Neklyudov et al, 2000).
۱٫هیدرولیزات پروتئین: هیدرولیزات پروتئین مخلوطی با ارزش غذایی بالا می باشد که توسط تیمار نمودن مواد پروتئینی طبیعی همچون کازئین، آب پنیر، سویا و… حاصل می شود. هیدرولیزات پروتئین مخلوطی است که در تنظیم فشار خون، فرمولاسیون غذای کودک، محصول رژیمی درمانی و افزودنی آب میوه ها و نوشابه های بدون الکل برای تقویت غذایی نقش بسزایی ایفا می نماید. با هیدرولیز نمودن مواد پروتئینی طبیعی، توسط پروتئازهای قلیایی می توان به محصولی با ارزش غذایی بالا دست یافت (Rebeca et al, 1991). سالانه معادل ۱۰۶×۱۴۵ لیتر آب پنیر از فرایند تهیه پنیر حاصل می شود که در صورت تیمار نمودن آن با پروتئاز قلیایی می توان محصول فراوانی با ارزش غذایی بالا تهیه نمود (Perea et al, 1993).
کاربردهای دیگر پروتئازها:
به غیر از کاربردهای مذکور که اصلی ترین استفاده های پروتئاز در صنعت می باشند می توان به سایر مواد کاربرد تجاری پروتئازهای میکروبی همچون بازیابی نقره از فیلم های عکاسی و اشعه ایکس مصرف شد (Gajji et al, 1996)، تهیه آسپارتام(شیرین کننده غیر قندی) (Rao et al, 1998)، مدیریت تبدیل پسماند های پروتئینی به بیوماس مفید (Ichida et al, 2002) و صنایع ابریشم اشاره نمود (Puri, 2001).
۱-۲-۸ سراشیا مارسسنس
سراشیا مارسسنس، باکتری گرم منفی، متعلق به خانواده انتروباکتریاسه است که با تولید سه آنزیم Lipase، DNAase و Gelatinase از سایر جنس های متعلق به این خانواده قابل تمایز می باشد. مشخصه دیگر این باکتری تولید رنگدانه قرمز غیر محلول در آب بنام پرودی جیوسین (Prodigiosin) است. این رنگدانه نوعی متابولیت ثانویه است که توسط Pseudomonas magneslorubra،Vibrio psychroerythrous وSerratia marcescens تولید می شود (Gerber, 1975).
پرودی جیوسین از رنگدانه های قرمز خانواده تری پیرولی است. فرآیند تولید این رنگدانه به صورت پیش سازهای منو و بی پیرول است که به صورت جداگانه سنتز شده و سپس به شکل نهایی پرودی جیوسین ترکیب می شوند (Boger& Patel, 1988). تولید رنگدانه تنها در درصد کمی از ایزوله ها دیده می شود. مطالعات نشان می دهد که سویه های فاقد توان تولید رنگدانه در تولید عفونت های بیمارستانی شاخص ترند. این باکتری مانند سایر اعضای خانواده انتروباکتریاسه، بر روی محیط کشت های سنتزی در شرایط هوازی به خوبی رشد می کند (Pryce& Terry, 2000) و (Mandarville, 2001) و (Nobutaka et al, 2001).
اندازه آن ۵/۰- ۸/۰ میکرومتر و طول آن ۹/۰-۲ میکرومتر است. کلونی های روی نوترینت آگار، مات، گرد، محدب، سفید و صورتی یا قرمز است(پیگمان معمولا در بعضی کلونی ها دیده می شود.) سراشیا مارسسنس در دماهای بین ۵ تا ۴۰ درجه سانتیگراد و در pH از ۵-۹ رشد می کند. رنگدانه در کلونی های قدیمی تر ناپدید می شود. بعضی از سویه ها فاقد رنگدانه هستند و حداقل یک سویه(D1) رنگدانه نارنجی-قرمزشدید تولید می کند که محو نمی شود. سراشیا مارسسنس از دیگر باکتری های گرم منفی به واسطه توانایی در هیدرولیز کازئین متمایز می شود که به آن اجازه تولید متالوپروتئینازهای خارج سلولی را می دهد. سراشیا مارسسنس باعث طیف وسیعی از عفونت ها مثل پنومونی، مننژیت، سپتی سمی، عفونت مجاری ادرار، اندوکاردیت، کونجانکتویت و عفونت زخم می شود.سراشیا مارسسنس تعدادی پروتئین خارج سلولی شناخته شده از جمله کیتیناز، همولیزین، سیدروفور، لیپاز، پروتئاز و نوکلئاز ترشح می کند (Hejazi& Falkiner, 1997) و (Kida et al, 2007).
طبقه بندی علمی
Kingdom: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Class: Gamma Proteobacteria
Order: Enterobacteriales
Family: Enterobacteriaceae
Genus: Serratia
Species: S. marcescens
۱-۲-۹ سراشیا پپتیداز و اهمیت آن
از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند. سراپپتیداز یک آنزیم پروتئولیتیک قوی است که اولین بار از باکتری سراشیا مارسسنسE-15 که در روده کرم ابریشم ژاپنی یافت شد، جدا گردید و دارای وزن مولکولی kDa 50 می باشد. همچنین این آنزیم به دلیل توانایی آن در درمان انسداد شریانی در بیماران مبتلا به بیماری عروق کرونر به عنوان آنزیم معجزه توصیف می شود. پزشکان در سراسر اروپا و آسیا مزایای ضد التهابی و ضد درد این ماده را به رسمیت شناخته اند و از آن به عنوان جایگزین سالیسیلات ها، ایبوپروفن و سایر داروهای ضد درد غیر استروئیدی در درمان استفاده می شود .سراپپتیداز تجزیه فیبرین، فعالیت ضد التهابی و ضد تورم را در تعدادی از بافت ها القا می کند و اثرات ضد التهابی آن نسبت به دیگر آنزیم های پروتئولیتیک بیشتر است. علاوه بر کاهش التهاب، یکی از بیشترین مزایای آن کاهش درد است که علت آن توانایی در جلوگیری از آزاد شدن آمین های القا کننده درد از بافت های ملتهب است (Raskin, 1999) و (Mazzone et al, 1990). سراشیوپپتیداز، برادیکینین، هیستامین و سروتونین را که باعث ورم (ادم)می شودرا هیدرولیز می کند و ورم را کاهش می دهد. سراپپتاز هم اکنون برای اهداف درمانی سنتز شده و فروخته می شود. این دارو در اروپا و ژاپن تحت نام ثبت شده Danzen و تحت نام های متنوعی شامل Danzen TM، Aniflazym TM، Serrazyme TM، Nemesulide، Serodase خرید و فروش می شود. این آنزیم تمایل خاصی به مولکول های پروتئینی مرده داشته، هضم و شکست پروتئین ها را در بدن بر عهده دارد و باعث تجزیه لخته خون، بافت زخمی و بافت مرده می شود. این آنزیم با پاکسازی فیبر ها از خون و سیستم لنفاوی و پاکسازی موکوس از طریق کاهش سلول های نوتروفیلی و از بین بردن التهاب از بدن به سیستم خود ایمنی کمک می کند تا عملکرد بهتری داشته باشد. در درمان شریان مسدود شده در بیماری های کرونر، پاکسازی پلاک های شریانی، کاهش میگرن و به حداقل رساندن اثرات بیماری قلبی و جلوگیری از حمله قلبی مفید است (Mohankumar et l, 2011).
۱-۲-۱۰ روش هایDNA نوترکیب و اهمیت آن
تکنیک های DNA نوترکیب در جهت جداسازی، وارد کردن و بیان ژن های موجودات مختلف در میزبانهای مختلف بکار رفته (Rao et al, 1998) و اهداف مختلفی را دنبال می کنند از جمله: بررسی توالی اسید نوکلئیک ژن مربوطه و یا تولید محصول آن ژن در میزبان دیگر به منظور خالص سازی و تولید انبوه در جهت مصارف صنعتی و اقتصادی. بنابراین در این راه، انتخاب میزبان تولید کننده پروتئین، سطح بیان محصول، بیان داخل و یا خارج سلولی، تغییرات پس از ترجمه و همچنین ویژگیهای رشد سلول میزبان از اهمیت بسزایی برخوردار است (Makrides, 1996).
۱-۲-۱۱ انتخاب میزبان بیان ژن
امروزه سیستم های بیانی زیادی از باکتریایی و مخمر گرفته تا حشرات و حیوانات در جهت بیان ژن خارجی به کاررفتهاست (Marino, 1989)، اما از میان تمامی سیستم های موجود، باکتری گرم منفی اشریشیا کولی بدلیل توانایی هایش بیشترین کاربرد را در این زمینه داشته است:
به سرعت رشد می کند.
محیط کشت آن ارزان می باشد.
ژنتیک آن کاملا” مشخص شده است.
براحتی می تواند وکتورهای کلونینگ را در خود تکثیر کند.

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت zusa.ir مراجعه نمایید.