کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- قسمت ۸

با فرمانتورهای بزرگ سازش پذیر می باشد.
بدلیل سابقه تاریخی استفاده از اشریشیاکولی، بسیاری از دستکاریهای ژنتیکی در جهت کاربردهای مختلف کلونینگ و بیان بر روی آن اعمال شده و گونه های تغییر یافته مختلفی از آن در سطح تجارتی تهیه شده و به راحتی در دسترس است (Banyx, 1999).
اما باید توجه داشت که تمامی ژن ها را نمی توان در سیستم اشریشیاکولی بیان کرد. مثلا” اگر محصول نوترکیب چند زیر واحدی بوده و یا اینکه احتیاج به تغییرات پس از ترجمه داشته باشد، بدلیل اینکه سیستم اشریشیاکولی توانایی ایجاد تغییرات پس از ترجمه رادر سطح بالا ندارد، بهتر است از میزبان های یوکاریوتیک استفاده شود. به هر حال اشریشیاکولی بعنوان یک سیستم بیانی، در جهت تولید بالا و اقتصادی بسیاری از پروتئین هایی که اندازه کوچک و ساختار ساده ای دارند، بسیار مفید می باشد.
۱-۲- ۱۲راهبردهای نسخه برداری (انتخاب حاملین بیان ژن)
در یک وکتور بیانی، عناصر اصلی و نحوه آرایش آنها باید بدقت طراحی شوند تا بیشترین سطح بیان را ایجاد کنند. این عناصر عبارتند از:
بخش شروع همانندسازی: برای افزایش تعداد نسخه های یک ژن، آن ژن را درون پلاسمیدها کلون کرده و این پلاسمیدها نیز در حالت استراحت خود همانندسازی و تعدادشان را در سلول میزبان افزایش میدهند (Cornelis, 2000).
مارکر مقاومت به آنتی بیوتیک: برای تشخیص سلولهایی که پلاسمید را پذیرفته اند و در ضمن اثر فشار انتخابی آنتی بیوتیک بر روی سلول ها برای نگه داشتن پلاسمید. وجود ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در پلاسمیدها ضروری است. بدین معنی که وقتی سلول در معرض آنتی بیوتیک قرار می گیرد، مجبور است برای زنده ماندنش پلاسمید حاوی ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را در خود نگه دارد (Jonasson et al, 2002).
پروموتر نسخه برداری: پروموتر، در فاصله ۱۰ الی ۱۰۰ نوکلئوتیدی بالا دست محل اتصال ریبوزوم قرار داشته و تحت کنترل ژنی تنظیمی است که این ژن یا جزئی از پلاسمید است یا در ژنوم میزبان قرار دارد. پروموترهای اشریشیاکولی معمولا” از دو هگزامر تشکیل شده که در ۱۰- و ۳۵- بالا دست نقطه شروع ترجمه قرار دارند (Mizukoshi, 1982)، اما پروموترهایی که در پلاسمیدهای بیانی بکار می روند باید اولا” بسیار قوی باشند تا نسخه برداری زیادی از روی ژن نوترکیب انجام شود و ثانیا” شدیدا” تحت کنترل باشند تا فقط در موقع القاء، ژن نوترکیب را بیان کنند، چون اگر در حین رشد سلول بیان بالا داشته باشیم، از رشد سلول جلوگیری شده و پس از قرارگیری سلول در موقعیت استرس، پلاسمید را حذف میکند. خصوصیت دیگری که باید در یک پروموتر بیانی وجود داشته باشد، آسان و ارزان بودن القاء آن می باشد. از پروموترهایی که امروزه در سطح وسیعی استفاده می شوند، پروموترهای trc یا tac هستند که از اپرون lacمشتق شدهاند و با IPTG القاء می شوند. اما چون این ماده بسیار گران می باشد، استفاده از آن در سطح بالا مقرون به صرفه نبوده و از جایگزین آن یعنی لاکتوز استفاده می کنند که با وجودیکه کمی ضعیف تر از IPTG عمل میکند، چون ارزانتر است مناسب تر می باشد (Makrides, 1996) و (Hanning& Makrides, 1998 ).
با توجه به مطالب ارائه شده در این قسمت، به شرح خصوصیات منحصر بفرد سیستم بیان pET که در این تحقیق از آن استفاده شده است نیز در مبحث بعد می پردازیم.
ناحیه شروع ترجمه
پایان دهنده های ترجمه و نسخه برداری
محل وارد کردن ژن
۱-۲-۱۳ سیستم بیان pET
رایج ترین سیستم بیانی که امروزه از آن استفاده می شود سیستم pET می باشد؛ بطوریکه حدود ۸۰ درصد پروتئین هایی که ساختار سه بعدی آنها در سال ۲۰۰۳ در بانک اطلاعاتی پروتئین (PDB) به ثبت رسیده است، درون سیستم های اشریشیاکولی بیان شده و ۹۰ درصد آنها از طریق سیستم pET صورت گرفته است (Rao et al, 1998). با وجودیکه در حال حاضر حدود ۴۰ نوع تجاری از سیستم بیانی pET وجود دارد، Studier و همکارانش برای اولین بار در سال۱۹۹۰ این سیستم را شرح دادند (Dubendorff& Studier, 1991).
این سیستم دارای پروموتورهای هیبرید، در محل وارد کردن ژن برای قرار گرفتن چند ژن در کنار هم و دیگر دستکاریهای ژنتیکی در جهت اهداف مختلف بیان می باشد. برای بیان ژن، این سیستم باید درون میزبانی قرار گیرد که توسط قطعه فاژی DE3 لیزوژنه شده باشد. قطعه DE3، T7RNA polymerase را کد کرده که تحت کنترل پروموتور lacUV5 بوده و بوسیله IPTG القاء می شود. از طرف دیگر ژن lacI که یک کپی از آن در ژنوم میزبان و یک کپی از آن در pET وجود دارد، بازدارنده LacI را تولید می کند که هم پروموتور lacUV5 میزبانی و هم پروموتور هیبریدی T7/lac پلاسمیدی را سرکوب می کند. پس وقتی که IPTG به محیط اضافه می شود، LacI را از هر دو اپراتور lac خارج و به خود می چسباند، و در نتیجهRNA polymerase T7 بیان شده و RNA پلیمراز حاصله، ژن موجود در پروموتور هیبریدی T7/lac را بیان می کند (شکل ۱-۳). بنابراین با توجه به اینکه توالی پروموتور T7 قابل شناسایی توسط RNA پلی مرازهای اشریشیا کولی نمی باشد، بیان خارج از کنترل وجود ندارد و چونRNA polymeraseT7 با سرعت ۲۳۰ نوکلئوتید در ثانیه الگوبرداری می کند، ۵ برابر سریعتر از RNA پلی مراز اشریشیا کولی عمل کرده و باعث می شود mRNA های فراوانی از روی ژن نوترکیب درون میزبان تولید شود. مناسب ترین میزبان برای بیان سیستم pET نیز اشریشیا کولی BL21 می باشد که هم قطعه DE3 و هم پروموتور lacUV5 را در ژنوم خود دارد (Sorensen& Mortensen, 2005).
شکل۱-۱) رونویسی ژنT7 (کد کننده T7 RNA Polymerase) در میزبان های سیستم بیانی pET ( لیزوژن های λDE3) توسط پروموتر L8-UV5کنترل می شود. ژنT7 بعنوان دومین ژن در یک mRNA پلی سیسترونی رونویسی می شود. بازدارنده lac (محصول ژن lac) به lacO1 متصل می شود و با اپراتورهای کاذب lacO2 و lacO3 به منظور جلوگیری از رونویسی توسطRNA Polymerase اشریشیاکولی برهمکنش می دهد. القاء کننده IPTG به بازدارنده متصل می شود و تمایل آن را به lacO1، کاهش می دهد و بنابراین رونویسی را امکانپذیر می سازد.
۱-۲-۱۴ استراتژی خالص سازی محصول نوترکیب
پس از تولید موفق پروتئین نوترکیب، باید چندین مرحله خالص سازی انجام گردد تا یک پروتئین با فعالیت بیولوژیکی تخلیص گردد. بطور کلی مراحل خالص سازی شامل ۳ مرحله می شود:
رها سازی پروتئین از سلول
خالص سازی اولیه
خالص سازی با روش های مختلف کروماتوگرافی
در مرحله اول اگر پروتئین بصورت داخل سلولی تولید شده باشد، توسط روش های مختلف لیز سلولی مثل سونیکاسیون و غیره پروتئین از سلول جدا می گردد ولی اگر محصول خارج سلولی باشد، احتیاجی به مرحله اول نمی باشد. هدف اصلی از خالص سازی اولیه، خارج کردن محصول از محیط کشت و همچنین غیرفعال کردن پروتئازها می باشد که معمولا” این مرحله را با دستگاه سانتریفیوژ و یا رسوب پروتئینی بوسیله نمک[۸] انجام می دهند. پس از این دو مرحله، چون محصول هنوز هم دارای ناخالصی های زیادی می باشد، برای خالص سازی نهایی، محصول حاصله را بر روی ستون های مختلف کروماتوگرافی وارد می کنند (Jonasson et al, 2002).
سیستم های تمایلی[۹]:
یکی از بهترین راه ها برای کاهش مراحل خالص سازی، استفاده از ستون های تمایلی برای پروتئین نوترکیب می باشد؛ به همین دلیل امروزه استفاده از قطعات ادغام شده به پروتئین های نوترکیب جهت خالص سازی های بعدی امری رایج می باشد.
اولین گزارش درباره استفاده از ادغام های ژنی در خالص سازی تمایلی به سال ۱۹۸۳بر می گردد (Uhlen et al, 1983 ) و از آن زمان تا به حال تعداد زیادی از سیستم های ادغامی تمایلی برای، Poly Histidin affinity tag می باشد که برای پروتئین هایی که مستعد ایجاد اجسام تجمعی[۱۰] هستند زیاد به کار می رود زیرا به راحتی می توان اجسام تجمعی را به ستونهای تمایلی فلزی چسبانیده و با محلولهای مناسب احیاء کرد.
این tag را می توان براحتی توسط تکنیک PCR به پروتئین نوترکیب متصل کرد. بعنوان مثال در سیستم pET توالی Poly-His قبل یا بعد از محل ورود ژن[۱۱] قرار داشته و در نتیجه پس از بیان ژن کلون شده، پروتئین نوترکیب دارای دنباله هیستیدینی[۱۲] بوده و براحتی می توان پروتئین نوترکیب را از دیگر پروتئین ها خالص کرد.
یکی از نکات منفی استفاده از قطعات ادغامی، جداسازی این قطعات پس از انجام مراحل خالص سازی از پروتئین نوترکیب می باشد. در نتیجه ممکن است ماده مورد استفاده برای تجزیه قطعه ادغامی، بر روی پروتئین نوترکیب هم اثر گذاشته و آن را تخریب کند. بنابراین امروزه آنزیم های خاصی طراحی شده که با ویژگی بالا قطعه ادغامی را تجزیه کرده ولی بر روی پروتئین نوترکیب اثری نمی گذارد (Jonasson et al, 2002).
هدف از انجام پروژه
امروزه آنزیم ها در صنایع مختلف کاربردهای فراوانی دارند بطوریکه در سال ۲۰۰۸ بازاری معادل ۳ میلیون دلار آمریکا صرف خرید آنزیم برای استفاده در صنایع گوناگون شده است. در این میان آنزیم هایی که نقش هیدرولیز کننده دارند مانند پروتئاز، آمیلاز، استراز و لیپاز حائز بیشترین اهمیت می باشد. در این میان ۴۰٪ از سهم فروش سالیانه آنزیمی (معادل ۱۳۰۰-۱۵۰۰ تن در سال) مربوط به پروتئاز ها می باشد. پروتئاز ها در صنایع گوناگون کاربرد دارند. بخش عمده ای از کاربرد آنها در شوینده ها به عنوان افزودنی و مابقی در صنایع غذایی و دارویی و چرم و تشخیص پزشکی استفاده می شود. از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند که این آنزیم هم چنین با نام های سرالیزین و سراشیا پپتاز و سراشیو پپتیداز شناخته می شود. با توجه به مزایای ضد التهاب و ضد درد این آنزیم، می توان از آن در صنایع دارویی بهره برد. به منظور تحقق این هدف، در ابتدا می بایست جداسازی سویه میکروبی از خاک های مناطق بومی ایران که مولد آنزیم سراپپتیداز می باشد صورت گیرد. سپس با بررسی ژن آنزیم های سراپپتیداز های جدا شده در مطالعات قبلی در بانک های ژنی مختلف، پرایمر های مناسب برای این آنزیم طراحی شده و شرایط مختلف برای جدا سازی این آنزیم از سویه مورد نظر بررسی می شود. چنانچه لازم باشد برای جدا کردن ژن این آنزیم کتابخانه ژنومی تهیه خواهد شد. بعد از جداسازی ژن آنزیم مورد نظر، یک وکتور بیانی مناسب مانند pET انتخاب شده و با استفاده از آنزیم های محدود الاثر مناسب این ژن در وکتور کلون خواهد شد. با مطالعات انجام شده یک سویه باکتری E.coliبه عنوان میزبان بیانی انتخاب شده و وکتور نوترکیب در آن ترنسفورم خواهد شد. سپس به بررسی بیان آنزیم در شرایط مناسب در میزبان فوق پرداخته و بهترین شرایط بیانی به منظور به دست آوردن حداکثر مقدار آنزیم فراهم می شود. چنانچه لازم باشد از روش های مختلف بهینه سازی به منظور افزایش راندمان تولید آنزیم استفاده خواهد شد و با استفاده از ستون های مختلف کروماتوگرافی مانند کروماتوگرافی تمایلی، آنزیم مورد نظر خالص خواهد شد و در مرحله آخر فعالیت آنزیم در شرایط مختلف دما، pH بررسی خواهد شد تا شرایط بهینه فعالیت آنزیم به دست آید.
فصل دوم
پیشینه تحقیق
۲-۱ ادبیات و سوابق مربوطه
در سال ۱۹۹۲ کلونینگ و بیان و ترادف یک ژن پروتئاز به نام tpr حاصل ازPorphyromonas gingivalis W83 در Escherichia coliانجام شد و بیان پروتئاز حاصل از Porphyromonas gingivalis از محیطLB Agar حاوی Skim milk1% جدا شده بود که کلون آن kb3 بود که برای پروتئازی با وزن مولکولی kDa64 کد شده بود و نتایج نشان داد که احتمالا پروتئاز بیان شده در Escherichia coli یک تیول پروتئاز است (Bourgeau et al, 1992).
در سال ۱۹۹۵ کلونینگ و آنالیز ترادف و تخلیص و ترشح لیپاز خارج سلولی توسطEscherichia coli از Serratia marcescens صورت گرفت. ژن کد کننده لیپاز خارج سلولی از Serratia marcescens توسط فاژ لامبدا در کتابخانه ژنومی مشخص شده است که در این تحقیق لیپاز از بخش شناور روی سطح کشت حامل وکتور بیان لیپاز خالص سازی شد و نتایج نشان داد که لیپاز حاصل از Serratia marcescens متعلق به گروهی از پروتئین های آنزیمی خارج سلولی ترشح شده توسط مسیر ترشحی کلاس ۱ می باشد (Xuyang et al, 1995).
در تحقیقی دیگر در سال ۱۹۹۷ کلونینگ، بیان و ترادف ژن پروتئاز ازBacteroides forsythus ATCC 43037 صورت گرفت که در این تحقیق ترادف نوکلئوتیدی DNA الحاقی در کلون شامل bp272/1 برای kDa8/47 کد شده است (Saito et al,l 1997).
در گزارشی در سال ۲۰۰۵ کلون سازی ژن رمز کننده آنزیم پروتئاز قلیایی ازBacillus licheniformis جدا شده از خاک صورت گرفت که پروتئاز این باسیلوس در دمای °C70و pH برابر ۱ پایدار می باشد و با استفاده از روشShutgun ژن پروتئاز قلیایی کلون و بیان ژن بررسی شد. همچنین توالی ژن مورد نظر بررسی و گزارش شد (Hesampour et al, 2005).
در یک تحقیق در سال ۲۰۱۱ کلونینگ ژن کد کننده پروتئاز خارج سلولی از باسیلوس استئاروترموفیلوس در Escherichia coli صورت گرفت. در این تحقیق وکتور نوترکیب در ۵αHD E.coliترانسفورم شد و نتایج نشان داد که ۱۴ کلون مثبت قادر به تولید پروتئاز خارج سلولی با توجه به تشکیل هاله ای از هیدرولیز بر روی پلیتSkim milk Agar پس از انکوباسیون در °C 37 برای مدت ۲۴ ساعت بودند (Asmaa et al, 2011).
فصل سوم
روش شناسی
۳-۱مواد شیمیایی

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت zusa.ir مراجعه نمایید.