جستجوی مقالات فارسی – کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- قسمت …

محیط کشت LB جامد (g/l)( Sajedi et al, 2004)
Tryptone 10; Yeast extract 5; NaCl 5; Agar 15; supplemented with ampicillin (100 mg/mL)/kanamycin (50 mg/mL) or
۵-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 40 µg/mL).
پس از سترون شدن محیط کشت در دمایC ˚۱۲۱ به مدت ۱۵ دقیقه و پائین آمدن دمای آن تا حدودC ˚۴۰، در صورت نیاز آنتیبیوتیک اضافه و سپس محیط کشت، در ظروف پتری سترون، تقسیم می شود.
محیط کشت جامدSOC برای رشد باکتری مستعد اشرشیا کولیE.coli XL1-blue (Sajedi et al, 2004)
تریتون (gr/lit20)، عصاره مخمر (gr/lit 5)، کلرید سدیم (gr/lit 5/0)، کلرید پتاسیم و M2کلرید منیزیم (mL 5 )
محیط کشت به منظور تشخیص پروتئاز (Joo et al, 2002)
Skimmed Milk Agar
Skim milk powder 100 (g/L)
Peptone 5 (g/L)
Agar 15 (g/L)
dH2O 1000 (mL)
برای تشخیص وجود پروتئاز از محیط Skim milk Agar استفاده شد. تولید پروتئاز به واسطه ایجاد هاله شفاف اطراف کلونی باکتری ثابت شد.
محیط کشت تولید آنزیم پروتئاز
Skim milk powder 2% (w/v)
Peptone 1.5% (w/v)
Glucose 2% (w/v)
Nacl 0.5 % (w/v)
بعد از حدود ۱۴-۱۶ ساعت از محیط پیش کشت به میزان ۱% به محیط کشت اصلی به منظور تولید پروتئاز تلقیح می کنیم. این محیط حاوی ترکیبات فوق می باشد و حجم نهایی با آب مقطر بهml 20 در ارلن های ml 100 رسانده می شود. مدت زمان لازم برای رشد و ترشح پروتئاز ۲۴ انتخاب شد.
۳-۳ روش سنجش فعالیت پروتئاز
برای تعیین فعالیت کازئینولیتیکی آنزیم ها ۲۵ میکرولیتر از محلول آنزیمی به ۲۲۵ میکرولیتر بافر تریس به علاوه ۲۵۰میکرولیترمحلول کازئین ۱% تهیه شده در بافر تریس اضافه گردید و در دمای C°۴۰ به مدت ۸ دقیقه انکوبه شد. سپس ۵۰۰ میکرولیتر محلول تریکلرواستیک اسید (TCA) 10% به مخلوط واکنش اضافه گردید تا واکنش متوقف شده و همچنین کازئین های هیدرولیز نشده باقیمانده، رسوب کنند. پس ازگذشت ۶۰ دقیقه در دمای °C 4 ، مخلوط واکنش را در g12000 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ کرده و جذب ۲۸۰ نانومتر محلول رویی را بعنوان معیاری از فعالیت آنزیمی در نظر گرفته شد. مخلوط مشابهی با این تفاوت که TCA 10% ابتدا به محلول سوبسترا افزوده شده و سپس محلول آنزیمی را بدان میافزاییم، بعنوان Blank درنظرگرفته شد (Pazhang et al, 2006).
۳-۴ مطالعات اولیه آنزیم شناسی
۳-۴-۱ اثر دما بر پایداری آنزیم
جهت بررسی پایداری حرارتی آنزیم محلول های آنزیمی در دمای °C85-55 انکوبه شدند. در فواصل زمانی مشخص نمونه ها را برداشته بلافاصله به یخ منتقل شدند. پس از نیم ساعت از یخ خارج شده و مطابق روش معمول فعالیت آنزیمی نمونه ها اندازه گیری شد. فعالیت نمونه ای از آنزیم که حرارت ندیده است سنجش شد(۱۰۰% فعالیت) و فعالیت نسبی همه نمونه های آنزیمی حرارت دیده نسبت به آن بدست آمد.
۳-۴-۲ اثرpH بر پایداری آنزیم
برای اینکه مقادیر pH،۱۰-۳ بررسی شود می بایست از مجموع چند بافری (Mixed buffe) استفاده شود.
Mixed buffer:
Citric acid +Tris HCl (50mM)
برای این منظور، درجه حرارت ثابت (دما ˚C37)، اما pH‌ محیط سنجش متغیر بود. ابتدا محلول چند بافری تهیه و با استفاده از محلول اسید کلریدریک و یا سود در pH های مختلف (۳ تا ۱۰) تنظیم شد. جهت بررسی فعالیت، سوبسترا که %۱ کازئین می باشد در بافرهایی با pH های مختلف تهیه گردید و فعالیت آنزیم طبق روش استاندارد اندازه گیری شد.
۳-۴-۳ دمای بهینه
برای این منظور، درجه حرارت متفاوت (۲۵-۳۵-۴۵-۵۵-۷۵-۷۵-۸۵) در نظر گرفته شد. جهت بررسی فعالیت، سوبسترا که %۱ کازئین می باشد در بافر Tris 20 میلی مولار با ۵/۷ pH تهیه گردید و فعالیت آنزیم در دماهای فوق الذکر طبق روش استاندارد سنجش شد.
۳-۴-۴ تعیین پارامترهای سینتیکی آنزیم
پارامترهای سینتیکی آنزیم پروتئاز با استفاده از سوبسترای کازئین و با رسم و بررسی نمودار میکائیلیس-منتن مطابق فرمول زیر بدست آمد. بدین منظور فعالیت آنزیم در غلظت های مختلف کازئین در شرایط معمول با استفاده از رسم نمودار استاندارد برای تیروزین ‌اندازه گیری شد.
V=
سپس با استفاده از نرم افزار Prism ، با وارد کردن داده ها منحنی میکائیلس-منتن رسم گردید.
۳-۵ جداسازی باکتری
میکروارگانیسم مورد نظر سویه وحشیSerratia marcescens ( ZF03) بود که از چشمه آب گرم
رامسر توسط دکتر اکبری و همکارانش جدا شد.
۳-۵-۱ استخراج DNA ژنومی
برای استخراج DNA ژنومی از روشی به نام Boiling استفاده می کنیم. بدین صورت که پس از تهیه کشت تازه از سویه مورد نظر در محیط کشت مایع،از کل محیط کشت به اندازه ml1 درون میکرو تیوب می ریزیم و سانتریفوژ می کنیم (min2، rpm6000). پس از دور ریختن محلول رویی، به مقدار ۲۰۰ میکرولیتر آب استریل اضافه کرده و سپس پیپتاژ می کنیم.بعد به مدت۱۵ دقیقه در دمای ۹۷ درجه سانتیگراد حرارت می دهیم و دوباره سانتریفوژ می کنیم (min5، rpm8000 .(سپس از مایع رویی جهت PCR استفاده شد.

برای دانلود فایل متن کامل پایان نامه به سایت 40y.ir مراجعه نمایید.