کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- قسمت ۱۲

Final extension temperature =72°C 10 min
در ضمن این پرایمرها جهت انجام کلونینگ طراحی شده ا ند. در هنگام طراحی پرایمرها سایت برش آنزیمهای Nde1 و Xho1در ابتدا وانتهای پرایمر نهاده شده است. وکتور مورد استفاده در اینجا هم (+) pET28-a بوده است.
۳-۶ روشهای الکتروفورزی
SDS-PAGE3-6-1
ژل آکریل امید ۱۰% در شرایط احیایی بر اساس روش لاملی[۱۴] (که معمولترین روش الکتروفورز در حضورSDS محسوب می شود)، ساخته شده و باندهای پروتئینی با رنگ آمیزی با کوماسی بریلیانت بلو R250 ظاهر شدند.
۳-۶-۲ الکتروفوزر ژل آگارز(۱۰۰)
تهیه بافر الکتروفورز۱۰X ) TBE
برای تهیه ۱ لیتر بافر TBE 10X ، ابتدا ۱۰۸ گرم از Tris baseو ۵۵ گرم بوریک اسید در ۹۰۰ میلی لیتر آب دوبار تقطیر شده حل شدسپس ۴۰ میلی لیتر از EDTA 0.5M (pH=8 ) به آن افزوده شده و حجم نهایی با آب مقطر به ۱ لیتر رسانده شد. برای انجام الکتروفورز ژل آگارز بافر باید به ۱X تبدیل گردید.
تهیه بافر الکتروفورز ( ۵۰X ) TAE
برای تهیه ۱ لیتر بافر TAE 50X ، ابتدا ۲۴۲ گرم از تریس باز در ۵۰۰ میلی لیتر آب دوبار تقطیر شده حل شد سپس ۱۰۰ میلی لیتر از EDTA 0.5M (pH=8 ) و ۵۷٫۱ میلی لیتر از اسید استیک گلاسیال به آن افزوده شدند وحجم نهایی با آب مقطر به ۱ لیتر رسانده شد. برای انجام الکتروفورز ژل آگاروز بافر باید به ۱X تبدیل گردد.
روش کار
غلظت ژل آگارز مورد استفاده برای مولکولهای DNA ژنومی و پلاسمیدی بین ۲/۱-۷/۰ می باشد و در اکثر موارد ژل ۱ درصد استفاده میشود. پودر آگارز برحسب درصد ژل و حجم بافر TAE 1X مصرفی، توزین شده و در بافر و با کمک حرارت حل شد. و پس از کاهش دما تا دمای °C 55 با توجه به حجم ژل (۱-۰٫۵ μg/ml ) اتیدیوم بروماید اضافه شد و داخل ظرف مخصوص(که دو طرف آن بر چسب زده شده و شانه در محل خود قرار داده شده) ریخته و بعد از انعقاد ژل (پلی مریزه شدن) الکتروفورز به صورت Submarine انجام می گیرد. بعد از به پایان رسیدن الکتروفورز برای دیدن باندهای DNA از دستگاه(Cambridge U.K)ُُُُُُُُُُُُُُُُُُُُُGel documentation استفاده شد.
۳-۷ فنون مربوط به DNA نوترکیب
۳-۷-۱ ساختار ناقل کلونینگ
برای کلونینگ از پلاسمید (+) pET28-aاستفاده شد، پلاسمید دارای طول bp 5369 می باشد. این وکتور حاوی توالیT7•Tag codingدرN ترمینال و توالی His•Tag codingدر C ترمینال ( این قسمت برای غربالگری آنزیم بیان شده با استفاده از ستون نیکل سفاروز لازم است)، منشا همانند سازی pBR322 و f1 ، ژن مقاوم به کانامایسین، پروموتر وترمیناتور T7 ، جایگاه های برش برای آنزیمهای محدودگر مختلف، این آنزیمها هر کدام دارای یک جایگاه برش بر روی ژن هستند، توالی کد کننده LacI هم در این وکتور وجود دارد. وکتور (+) pET28-a برای اهداف مختلفی از جمله کلونینگ DNA، تعیین توالی DNA ، بیان ژن و … طراحی شده است.
الف
 ب
شکل۳-۱ ) ناقل کلونینگ PET 28a ، ا لف) ساختار ژنتیکی، ب ) منطقه کلونینگ/ بیان ناقل PET 28a
۳-۷-۲ آماده سازی قطعه DNA برای انتقال به درون وکتور
بعد از انجام مراحل PCR و به دست آوردن غلظت مناسبی از ژن مورد نظر تمام محصولات روی ژل آگارز برده شد، اگر باند حاصل شارپ باشد و محصول PCR بر روی ژل فاقد باند غیر اختصاصی باشد، این DNA برای انجام کلونینگ برده می شود. اگر بر روی ژل باند غیر اختصاصی مشاهده شود یا همراه باند اصلی، اسمیر هم باشد باید باند اصلی را از روی ژل استخراج گردد.
۳-۷-۳ استخراج DNA از روی ژل
ابتدا ژل ۱ درصد آگاروز تهیه شده و با متصل کردن دندانه های شانه، ژلی با چاهک های بزرگتر تهیه گردید. بدین ترتیب کل محصول PCR درون چاهک ها خالی شده و الکتروفورز انجام گرفت. بعد از اتمام الکتروفورز باند مورد نظر در زیر لامپ UV وبا کمک یک تیغ سترون شده بریده شده و داخل ویالی که قبلا توزین گردیده بود، ریخته شد و سپس بر اساس protocol کیت استخراج DNA (Fermentas KO531) خالص سازی گردید.
۳-۷-۴مراحل کلون مجدد
الف- هضم آنزیمی
از آنجا که پرایمرهای طراحی شده دارای جایگاه برش آنزیم های محدودگرNde1وXho1می باشد، جهت کلون مجدد، در ابتدا دو واکنش هضم آنزیمی به ترتیب با Nde1 وXho1 به مدت ۵ ساعت بطور همزمان بر روی محصول PCRو پلاسمید pET28-aانجام شد. در اینجا از بافر Oاستفاده گردید. ترکیب واکنش هضم آنزیمی در حجم ۲۰ میکرولیتر به صورت زیر می باشد:
۱۰µl D W; 2µl 10X buffer; 2µl restriction enzyme; 6 µl PCR product /pET28-a
لازم به ذکر است که پس از هر واکنش آنزیمی تخلیص محصول واکنش با کیت PCR product Clean up انجام می شد.
ب- واکنش الحاق
واکنش الحاق محصول PCRو پلاسمید هضم شده انجام شد. واکنش الحاق شامل ترکیبات زیر و در حجم۲۰ میکرولیتر با نسبت های بیان شده می باشد:
جدول ۳-۲ نسبت های واکنش الحاق

۱۰X buffer (μl) T4 DNA ligase (μl) Digested insert (μl) Digested pET28-a (μl) DW (μl) Pmol plasmid: pmol DNA
دانلود متن کامل این پایان نامه در سایت abisho.ir