مقاله – کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- قسمت ۱۳

۲
۲
۲

۱
۱
۱

۶
۶
۱۰

۶
۲
۲

۵
۹
۵

۱:۱
۱:۳
۱:۵

مخلوط الحاق در C˚۱۶ به مدت ۱۶ ساعت انکوبه شد.
ج-انتقال DNA (ترانسفورماسیون)
پس از انجام واکنش الحاق و تخلیص محصول واکنش با کیت Cleanup، انتقال با روش شیمیایی در میزبان E.coliDH5α طی مراحل زیر انجام شد.
۳-۷-۵ مستعد کردن باکتری DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0)
باکتری مستعد، باکتری است که توانایی ترانسفورم شدن با یک قطعه DNA خارجی را داشته باشد. برخی باکتریها در مرحله رشد لگاریتمی و فاز ثابت، به طور خود به خود مستعد دریافت ژن می شوند اما باکتری (اشریشیا کولی) DH5α طی مراحل زیر به طور مصنوعی تبدیل به سلولی مستعد دریافت DNA میگردد:
۱- یک کلونی باکتری از پلیت LB درmL 5 محیط LB مایع کشت و به مدت یک شب در دمای C˚۳۷انکوبه گردید.
۲- روز بعد μl 100 از این محیط کشت در mL 5 محیط کشت جدید تلقیح و تا رسیدن جذب نوری آن در طول موج ۶۰۰ نانومتر به ۳/۰ الی ۵/۰ درC˚۳۷ انکوبه شد.
۳- فالکون مورد نظر به مدت ۵ دقیقه درrpm 6000 و دمای C˚۴ سانتریفیوژ شد.
۴- محلول رویی دور ریخته شد و سپس رسوب به آرامی در۶۰۰ میکرولیتر کلرید کلسیم ۱۰۰ میلی مولار سرد حل گردید. پس از آن تیوب به مدت ۴۵ دقیقه درون یخ قرار داده شد. در پایان ۴۵ دقیقه، سانتریفیوژ با شرایط قبلی انجام گرفت.
۵- محلول رویی سانتریفوژ دور ریخته شده، رسوب در ۲۰۰ میکرولیتر کلرید کلسیم سرد حل گردید. این ۲۰۰ میکرولیتر به ۴ میکروتیوب، هرکدام ۵۰ میکرولیتر، تقسیم شد. ۲ میکروتیوب مخصوص واکنش تست، ۱ میکروتیوب مخصوص کنترل منفی و ۱ میکروتیوب نیز مخصوص کنترل مثبت انتقال.
۳-۷-۶ انتقال محصول الحاق به درون باکتری مستعد DH5α
۱- به باکتریهای مستعد در ۲ میکروتیوب تست، مقدار۱۰ تا ۱۵ میکرولیتر محصول الحاق، به میکروتیوب کنترل مثبت نیز pET28-a هضم نشده افزوده شد، و به میکروتیوب کنترل منفی هیچ نوع مولکول DNA ای اضافه نگردید. لازم به ذکر است که مقدار باکتری های مستعد در هر میکروتیوب ۱۵۰ میکرولیتر است.
۲- میکروتیوبها به مدت ۳۰ دقیقه درون یخ قرار داده شدند.
۳- سپس به مدت ۵ دقیقه در ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شدند.
۴- مجدداً میکروتیوب ها به مدت ۲ دقیقه درون یخ قرار داده شدند.
۵- ۸۰۰ میکرولیتر از محیط کشت LB بدون آنتی بیوتیک به هرکدام از میکروتیوب ها اضافه و به مدت یک ساعت درC˚۳۷ انکوبه گردیدند.
۶- پلیت های LB آگار حاوی آنتی بیوتیک به مدت ۳۰ دقیقه قبل از استفاده در دمای C˚۳۷ انکوبه شدند.
۷- محتوای میکروتیوب ها به مدت ۳ دقیقه درrpm5000 سانتریفیوژ شده، محلول رویی به شکلی دور ریخته شد که ۳۰ میکرولیتر از محیط کشت به همراه توده باکتریایی باقی ماند.