جستجوی مقالات فارسی – کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- قسمت ۱۴

۸- توده باکتری باقی مانده به اضافه مایع رویی خوب پیپتاژ شد و بر روی سطح LB آگار واجد آنتی بیوتیک کانامایسین پخش گردید.
۹- در نهایت پلیت ها در C˚۳۷ به مدت ۱۶-۱۸ ساعت انکوبه شد.
بعد از این مدت اگر انتقال پلاسمید نوترکیب به درون باکتری با موفقیت انجام شده باشد، کلونی های مقاوم به آنتی بیوتیک (کانامایسین) روی پلیت دیده می شوند.
د) تعیین پلاسمیدهای نوترکیب
برای تأیید کلونی‌های حاوی ژن نوترکیب از روش Cracking استفاده شد. در این روش ابتدا پلیت های مادر LB آگارحاوی کانامایسین تهیه و هر یک به ۲۲ قسمت تقسیم شد، سپس همه کلونی های بدست آمده بر روی این پلیت ها کشت داده شد و در دمای C˚۳۷ به مدت ۱۲ ساعت انکوبه شد. پس از رشد کلونی ها، از روش Cracking به صورت زیر استفاده شد:
۳-۸ بافر Cracking
EDTA 5 mM; NaOH 50 mM، SDS 0.5%
روش کار:
از بافر Cracking به مقدار ۲۰ میکرولیتر داخل میکروتیوب ها ریخته شد. سپس کلونی ها به مقدار مناسب (به اندازه سر لوپ) در بافر مذکور معلق شد.
میکروتیوب ها به مدت ۳۰ دقیقه در دمای C˚ ۵۵ انکوبه شد.
پس از انکوباسیون، میکروتیوبهای حاوی باکتری به مدت یک دقیقه ورتکس شد.
در این مرحله loading dye به آن افزوده شد.
نمونه های آماده شده بر روی ژل الکتروفورز ۱% برده شد.
پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید، کلونی های حاوی پلاسمید نوترکیب در مقایسه با انواع بدون قطعه ژنی مورد نظر مشخص شد.
ه) تأیید کلونی های نوترکیب
برای تأیید ورود ژن مورد نظر در حامل بیانی pET28-a، پلاسمید نوترکیب در مقیاس کم از کلونی‌های تأیید شده و رشد یافته در محیط LB مایع حاوی کانامایسین با استفاده از کیتBioneer استخراج شد. برای بررسی کیفیت پلاسمید استخراج شده، ۱ میکرو لیتر از نمونه روی ژل اگارز ۱ درصد، الکتروفورز و غلظت آن با مقایسه با اندازه نمای DNA تخمین زده شد. سپس با پرایمر های کلونینگ واکنش PCR انجام شد و در نهایت نمونه پلاسمیدی برای تعیین توالی ارسال شد.
و) تعیین توالی نوکلئوتیدی
پس از دریافت نتیجه تعیین توالی، کیفیت توالی از روی ارتفاع امواج ثبتی حاصل بررسی شد. سپس توالی حاصل با استفاده از نرم افزار BLAST در پایگاه اینترنتی NCBI، جهت اطمینان از عدم ایجاد جهش و حذف ترادف نشانه ای در توالی کدکننده سراپپتیداز، مورد بررسی قرار گرفت.
ی) انتقال پلاسمید pET28-a (+) نوترکیب حاوی ژن کدکننده پروتئاز به درون باکتری BL-21 (برای بیان)
انتقال پلاسمید نوترکیب تخلیص شده به درون باکتری BL-21 به روش شیمیایی مذکور در بخش های قبل انجام شد.
۳- ۹بیان ژن سراپپتیداز و تعیین خلوص آن توسط SDS-PAGE
۳-۹-۱القاء باکتری و بیان پروتئین های نوترکیب
شرایط بیان پروتئین نوترکیب: یک غلظت IPTG، در دمای C˚۱۸ به مدت ۹ ساعت و بعد از آن در دمای C˚۲۷ به مدت ۱۵ ساعت انکوباسیون به روش ذیل، در حجم ۵۰ میلی لیتر مورد استفاده قرار گرفت:
یک کلونی از کلونی های مثبت درmL 25 محیط LB دارای کانامایسین، (در یک ارلن ۵۰ میلی لیتری) تلقیح و به مدت یک شب در C˚۳۷ انکوبه شد.
یک ارلن حاوی ۲۵۰ میلی لیتر محیط LB دارای کانامایسین با غلظتmg/mL 50 تهیه شد. سپس با ۲٫۵ میلی لیتر از محلول کشت مرحله قبل تلقیح شد.
ارلن برای رسیدن به ۰٫۷-۰٫۵OD600 = ، در دمای C˚۳۷ و با شیک rpm 200 انکوبه شد.
پس از رسیدن به کدورت مطلوب، از ارلن به اندازه ۱ میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری به عنوان نمونه قبل از القاء برداشته شد و در C°۲۰- نگهداری شد.
به ارلن، ۲۵۰ میکرولیتر IPTG (mM 100)، با غلظت نهایی ۱ میلی مولار اضافه شد. طبق تنظیماتی که قبلا” انجام شده بود پس از ۲۴ ساعت که بیان پروتئین به بیشترین حد خود می رسد، ارلن از انکوباتور خارج شد. به اندازه یک میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتریهای القاء شده به عنوان نمونه پس از القاء در داخل یک میکروتیوب برداشته و در فریزر C°۲۰- نگهداری شد. محتویات هر ارلن خارج شده از انکوباتور در داخل فالکون ها تقسیم شده ، سانتریفیوژ شد (g 5000 و ۲۰ دقیقه)، و سپس مایع رویی دور ریخته شد. کل توده باکتری باقیمانده با ۴ میلی لیتر Tris-HCL (pH 8) شستشوداده شدو مجددا” با شرایط قبلی سانتریفیوژ و مایع رویی دور ریخته شد. پس از آن فالکون ها به دمای (C˚۲۰-) انتقال یافتند.
۳-۹-۲بررسی بیان پروتئین های نوترکیب با استفاده از روش الکتروفورز
به منظور بررسی بیان پروتئین های نوترکیب تحت شرایط اعمال شده، لوله های میکروتیوب حاوی نمونه های جمع آوری شدهاز فریزر C˚۲۰- خارج شد و پس از قرار گرفتن در دمای محیط، سانتریفیوژ شده (rpm13000، min 5) و بخشی از محلول رویی و رسوب باکتری حاصل در بافر نمونه حل شد. نمونه هایی که بدین ترتیب آماده شدند پس از پیپتاژ کردن به مدت ۵ دقیقه در حمام آب جوش، جوشانده شد و برای انجام الکتروفورز آماده گردید.
الکتروفورز پروتئین ها به روش SDS-PAGE
الف- مواد و محلول های مورد نیاز برای انجامSDS-PAGE
محلول Stock %30 آکریل آمید- بیس آکریل آمید
Acrylamide; 29 g، N،N’-bisacrylamide; 1 g، DW; 100 mL
مواد فوق با رعایت توصیه های ایمنی (پوشیدن دستکش و زدن ماسک) توزین شده و در یک ارلن مناسب تهیه گردید، دور آن کاملاً فویل پیچیده، در C˚۴ نگهداری شد.
آمونیوم پرسولفات (APS) (%10)
Ammonium per sulfate; 0.1 g، DW; 1mL
بافر ژل پایین
Tris-base; 18.2 g، SDS; 0.4 g، DW up to 100 mL (pH 8.8)
بافر ژل بالا

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت zusa.ir مراجعه نمایید.