سایت مقالات فارسی – کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- قسمت ۱۵

Tris-base; 6.1 g، SDS; 0.4 g، DW up to 100 mL (pH 6.8)
بافر الکترود (بافر تانک)
Tris-base; 3.0 g، SDS; 1 g، Glycine; 14.4g، DW up to 1000 mL
بافر نمونه (۵X)
Glycerol; 5 mL، SDS; 1 g، ۲-mercaptoethanol; 1 mL، upper gel buffer; 10 mL، DW up to 20 mL
محلول TEMED(%10)
TEMED; 0.1 mL، DW; 0.9 mL
این محلول بایستی بطور تازه تهیه و مصرف شود.
محلول رنگ کننده ژل
Coomassie Brilliant Blue R-250; 2.5 g، Methanol; 450 mL، Acetic acid; 100 mL، DW; up to 1000 mL
محلول رنگ بر
Methanol; 450 mL، Acetic acid; 100 mL، DW; up to 1000 mL
دو محلول فوق باید در دمای اتاق و در محلی تاریک نگهداری شود.
ب- روش انجام SDS-PAGE
به ترتیب مواد ژل پایین با هم مخلوط گردیده، بین شیشه ها ریخته شد. ژل پایین با توجه به اندازه پروتئین نوترکیب % ۱۲٫۵ تهیه شد.
پس از انعقاد ژل پایین، مواد ژل بالا مخلوط و پس از آماده شدن، بین شیشه ها ریخته و بلافاصله شانه ایجاد کننده چاهک مابین شیشه ها جهت ایجاد چاهک ها قرار داده شد. ژل بالا %۵ تهیه گردید. پس از بسته شدن ژل، شانه خارج و درون چاهک ها با آب مقطر شسته شد.
نمونه های تهیه شده در بافر نمونه (Sample buffer) به مدت ۵ دقیقه در حمام آب گرم (C˚۱۰۰) جوشانده شدند. سپس با استفاده از سرنگ هامیلتون نمونه ها بدقت درون چاهکها ریخته شدند. عمل الکتروفورز با ولتاژ ۱۰۰ ولت ، به مدت ۴ ساعت انجام گرفت. بعد از ۴ ساعت جریان را قطع کرده، بدقت با زدن آب مقطر بین دو شیشه و جدا کردن شیشه ها، به آرامی ژل را خارج کرده، درون ظرف رنگ آمیزی قرار داده شد.
ژل توسط محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو به مدت ۳۰ دقیقه رنگ آمیزی و در نهایت آن را توسط محلول رنگ بر، رنگ زدایی کرده، تا باندهای پروتئینی ظاهر شوند.
۳-۱۰ تخلیص پروتئین های نوترکیب
۳-۱۰-۱بافر های مورد نیاز تخلیص پروتئین نوترکیب
همه بافرهای بیان شده در زیر دارای ۸ pH می باشند.
بافر لیز
Tris-base; 50 mM، NaCl; 300 mM، Imidazole; 20 mM، PMSF; 1 mM
بافر شستشو
Tris-base; 50 mM، NaCl; 300 mM، Imidazole; 30 mM
Tris-base; 50 mM ،NaCl; 300 mM، Imidazole; 100 mM
بافر جدا سازی(Elution buffer)
Tris-base; 50 mM، NaCl; 300 mM، Imidazole; 250 mM
۳-۱۰-۲روش تخلیص پروتئین نوترکیب
تخلیص پروتئین ‌نوترکیب به‌ روش ‌کروماتوگرافی ‌تمایلی[۱۵] و با استفاده از ستون نیکل سفارز[۱۶] مطابق با دستور العمل انجام گرفت. آنزیم نوترکیب دارای دنباله هیستیدینی[۱۷]درانتهای ‌کربوکسیل[۱۸] خود است. این دنباله تمایل زیادی به نیکل دارد و میانکش محکمی با آن برقرار می‌کند.
باکتری‌های ‌کشت داده شده و القاء‌ شده به ‌مدت ۲۰ دقیقه‌ در rpm 7000 ودمای ‌۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد. رسوب ‌باکتری به دست ‌آمده‌ با افزودن ۴ میلی‌لیتر بافر لیز کننده ‌(هم حجم رسوب)، به حالت سوسپانسیون در آمد. پس از آن سوسپانسیون باکتری تحت سونیکاسیون قرار گرفت. برنامه سونیکاسیون شامل ۱۰ مرحله ۲۰ ثانیه‌ای با فاصله زمانی۴۰ ثانیه بین هر مرحله بود. به علاوه برای‌ جلوگیری‌ از تخریب ‌گرمایی ‌تمامی‌ مراحل‌ سونیکاسیون در حضور یخ انجام گرفت. باکتری های لیز شده، در rpm 12000 و در دمای ۴ درجه سانتی گراد به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفیوژ شد.
به منظور تخلیص پروتئین از سوپ رویی پس از سونیکاسیون که حاوی پروتئین نوترکیب است مراحل زیر انجام شد: (سرعت پمپ پریستالتیک در تمام مراحل mL/min 2 می باشد بجز مرحله سوم یا بارگیری پروتئین بر روی ستون که در آن سرعت پمپ mL/min 0.5 می باشد)
متراکم کردن[۱۹] ستون با رزین نیکل سفارز در حجم۲ میلی لیتر.
به تعادل رساندن ستون با بافر لیز (۷ میلی لیتر).
ریختن سوپ رویی حاصل از سونیکاسیون بر روی ستون نیکل (۱ میلی لیتر).
شستن ستون با بافر شستشو به اندازه حداقل سه برابر حجم ستون (۱۲ میلی لیتر).
شستن ستون با بافر جداسازی (۹ میلی لیتر).
شستن ستون با الکل ۲۰% جهت نگهداری طولانی مدت ستون (۶ میلی لیتر).
تمام خروجی های ستون در مراحل بالا در لوله های آزمایش جمع آوری می شود. برای جلوگیری از تخریب گرمایی پروتئین، تخلیص در یخ و با استفاده از بافرهای سرد انجام گرفت. در نهایت پروتئین تخلیص شده در یخچال °C 4 نگهداری شد.
آماده سازی پروتئین جهت مطالعات آنزیمی

دانلود کامل پایان نامه در سایت pifo.ir موجود است.