مقاله – کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- …

پس از تعیین فعالیت آنزیمی به روشی که در قسمت بعد شرح داده خواهد شد و اطمینان از خلوص پروتئین (پروتئین تک باند بر روی ژل SDS-PAGE) همه نمونه های خالص از هر آنزیم روی هم ریخته شد.
فصل چهارم
تجزیه و تحلیل داده ها
۴-۱جداسازی باکتری
میکروارگانیسم مورد نظر سویه وحشی Serratia marcescens (ZF03)بود که از چشمه آب گرم رامسر
توسط دکتر اکبری و همکارانش جدا شد.
۴-۲ استخراج DNAژنومی
همان طور که گفته شد برای استخراج DNA از روشBoiling استفاده شد که با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز نمونه بررسی گردید.
۴-۳ رسم درخت فیلوژنتیکی
محصول PCR بعد از تعیین توالی، ۱۵۰۰ جفت باز را نشان داد که با مقایسه با سایر ژنهای ۱۶SrDNA گونه های سراشیا مارسسنس موجود در مرکز ملی بیوتکنولوژی NCBIwww.ncbi.nlm.nih.gov)) درخت فیلوژنتیکی برای آن رسم گردید و نتایج حاصل از تطبیق[۲۰] و درخت فیلوژنتیکی نشان دادند که گونه Serratia marcescens ZF03 به گونه های Serratia marcescens ZhenJiang و Serratia marcescens HR-3 نزدیک می باشد .
شکل۴-۱: درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده ازNCBI ( www.ncbi.nlm.nih.gov)
۴-۴ کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بیانیpET28-a (+)
در طی بهینه سازی شرایط PCR دمای C˚۵۷ به عنوان بهترین شرایط دمایی بدست آمد و واکنش های PCR بعدی در این دما گذاشته شد.
بpET 28a الف
 
۱۵۰۰
۱۵۰۰
شکل۴-۲الف)الکتروفورز محصول واکنش PCRژن آنزیم سراپپتیدازب) الکتروفورز محصول واکنش هضم آنزیمی دوگانه بر روی ژن سراپپتیداز و پلاسمید pET28-a (+)1-اندازه نمای DNA(DNA ladder 10 kbp ۲-Pet28-a برش خورده با آنزیمهای محدودگر ۳-ژن برش خورده با آنزیم محدودگر
و در مرحله بعد هضم آنزیمی با دو آنزیم Nde1 وXho1 انجام شد(شکل۳-۶ ب). محصولات واکنش هضم دوگانه آنزیمی برای انجام واکنش الحاق بکار برده شدند. از میان سه نسبت اعمال شده، بیشترین تعداد کلونی های نوترکیب، برای نسبت وکتور به قطعه ژنی به ترتیب ۳ به ۱ مشاهده شد.
برای تشخیص کلونی های حاوی پلاسمید نوترکیب از روش Cracking استفاده شد. بدین منظور، حدود ۴۰ کلونی بر روی پلیت های تقسیم بندی شده کشت داده شد.
جهت استخراج پلاسمید های نوترکیب از بافر Cracking استفاده شد و پس از اجرای روش، همه نمونه ها بر روی ژل آگارز ۱% الکتروفورز شد.
سه نمونه ای که با فلش نشان داده شده است حاوی ژن می باشد که جهت کارهای بعدی انتخاب شدند. از نمونه های زیر استخراج پلاسمید صورت گرفت که در شکل۴-۳نشان داده شده است:
شکل ۴-۳:الکتروفورز پلاسمید های استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking. نمونه شماره ۷، ۱۳ و ۱۷ ژن را دریافت کرده اند. P پلاسمید .Pet 28a بدون ژن.M مارکر
.
PET28a
شکل۴-۴:نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن
در تأییدی دیگر، نمونه پلاسمیدی شماره های۷ و۱۳ و۱۷ که در شکل نشان داده شده، به عنوان الگو در واکنش PCR با پرایمرهای ویژه کلون کردن ژن آنزیم، مورد استفاده قرار گرفت.
شکل(۴-۵) نتایج صحت کلونینگ را نشان میدهد و یک قطعه bp1500کلون شده است که معادل ژن مورد نظر می باشد.
شکل ۴-۵: محصول واکنش PCR بر روی پلاسمید نوترکیب حاوی ژن آنزیم سراپپتیداز۱- محصول PCR انجام شده بر روی پلاسمید نوترکیب به عنوان کنترل مثبت ۲- محصول PCR انجام شده برروی پلاسمید نوترکیب pET 3- اندازه نمای DNA(DNA ladder 10 kbp) 4و۵- هضم آنزیمی ژن مربوطه
۴-۵ بیان و تخلیص ژن سراپپتیداز نوترکیب
به منظور بیان پروتئین نوترکیب، از سویه اشرشیاکولیBL-21 استفاده شد. برای این منظور پلاسمید نوترکیب تأیید شده در مقیاس کم از کلونی XL1-blue استخراج شد و برای ترانسفورماسیون در سویه BL-21 مورد استفاده قرار گرفت. کلونی های مثبت سویه BL-21 که پلاسمید نوترکیب pET28-a (+) را دریافت کرده بودند، باز هم به روش الکتروفورز روی ژل آگارز برای پلاسمید نوترکیب و نیز PCR تأیید شدند. سویه BL-21 برای بیان پروتئین نوترکیب مورد استفاده قرار گرفت. در تعیین شرایط بهینه دمای ۱۸ درجه سانتیگراد به مدت ۹ ساعت و بعد از آن دمای ۲۷ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ ساعت و غلظت ۱mM IPTG و زمان ۲۴ ساعت بعد از القاء با شیکrpm 200به عنوان بهترین شرایط القاء در نظر گرفته شد. مقایسه باندهای پروتئینی حاصل از عصاره سلولی نمونه القاء شده و نمونه قبل از القاء بر روی ژل SDS-PAGE بیان پروتئین نوترکیب را تحت شرایط اعمال شده نشان داد.
شکل۴-۶: ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده۱- مارکر جرم ملکولی پروتئین (kDa) 2- نمونه قبل از القا,۳- نمونه بعد از القا,۴- باند پروتئینی تخلیص شده
۶۵
پس از بیان پروتئین نوترکیب، تخلیص آن با استفاده از ستون نیکل سفارز انجام شد. همه محلول های پروتئینی جدا شده در طی تخلیص، بر روی ژل SDS-PAGE، الکتروفورز شد و انواع خالص آن شکل جهت مطالعات آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت. وزن پروتئین نوترکیب، حدود ۶۵ کیلو دالتون تخمین زده شد.
۴-۶ منحنی استاندارد
به منظور به دست آوردن فعالیت آنزیمی برحسب واحد آنزیمی(Unit) برای سوبسترای کازیین، منحنی استاندارد تیروزین رسم شد. ابتدا حدود ۱۰ غلظت مناسب از تیروزین تهیه شد و مراحل بعدی مطابق همان روش سنجش آنزیمی انجام گردید. بعد از این با استفاده از جذب محلولهای استاندارد تیروزین و نمونه های آنزیمی، منحنی استاندارد تیروزین (جذب علیه μmolتیروزین) رسم گردید.
نمودار۴-۷ : منحنی استاندارد غلظت تایروزین
۴-۷ اثرpH روی فعالیت آنزیم
فعالیت این آنزیم در pH های بین ۳ تا۱۰ اندازه گیری شد. pH بهینه فعالیت آنزیم ۷ می باشد. به طوریکه فعالیت آنزیم از pH حدود ۶ شروع شده و در ۷pH به بیشترین میزان خود می رسد و پس از آن فعالیت آنزیم به تدریج کاهش می یابد.
نمودار ۴-۸: تاثیر pH روی فعالیت سراپپتیداز. سنجش فعالیت آنزیم در pH های مختلف در بافرهای Tris-HCl (از pH 5/7 تا ۱۰) و سیتریک اسید (pH 3 تا ۷) انجام شد.

دانلود کامل پایان نامه در سایت pifo.ir موجود است.