علمی : کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس۹۲- قسمت …

۴-۸ دمای بهینه آنزیم
برای این منظور، درجه حرارت متفاوت (۲۵-۳۵-۴۵-۵۵-۶۵-۷۵-۸۵) در نظر گرفته شد.جهت بررسی فعالیت، سوبسترا که %۱ کازئین می باشد در بافرتریس۵۰ میلی مولار با۵/۷ pH تهیه گردید.مشخص شد که دمای بهینه برای فعالیت این آنزیم دمای ۴۵ درجه می باشد. فعالیت آنزیم در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد در کمترین مقدار خود بوده و به تدریج افزایش می یابد تا اینکه در دمای ۴۵ درجه سانتیگراد به بیشترین مقدار خود رسیده و پس از آن به تدریج کاهش می یابد و از دمای ۶۵ درجه سانتیگراد به صفر می رسد.
نمودار ۴-۹: اثر دما بر روی فعالیت آنزیم سراپپتیداز. آنزیم خالص شده به همراه سوبسترا در دماهای مختلف (۲۵-۳۵-۴۵-۵۵-۶۵-۷۵-۸۵) انکوبه شد و سنجش فعالیت آنزیم به منظور تعیین دمای بهینه انجام شد.
۴-۹ بررسی خصوصیات کاتالیتیک آنزیم
برای تعیین پارامترهای سینتیکی آنزیم از سوبسترای کازئین استفاده شد. سینتیک این آنزیم برای سوبسترا از نوع Michaelis-Mentonاست. با رسم نمودار Michaelis-Menton ، Km و Vmax آن برای کازئین محلول در دمای °C45 و ۷pH = اندازه گیری شد.
 
نمودار۴-۱۰:منحنی Michaelis-Menten از فعالیت پروتئازی در حضور غلظت های مختلف کازئین در pH 7 و دمای °C45.
فصل پنجم
بحث و نتیجه گیری
۲۰ آنزیم از میان هزاران آنزیمی که شناسایی و خصوصیات بیوشیمیایی آنها تعیین شده است، ۹۰% آنزیم های کاربردی در صنعت را تامین می کنند. دلیل این امر، مطابقت خصوصیات فیزیکوشیمیایی این دسته از آنزیم ها با شرایط صنعتی است که در آن کاربرد دارند (Bronscheuer& Pohl, 2001). از بین آنزیم های صنعتی پروتئازها ۶۰% کل فروش آنزیم های جهانی را به خود اختصاص می دهد (Rao et al, 1998) و بطور گسترده در صنایع مختلف از جمله مواد غذایی، مواد شوینده، داروسازی، چرم سازی و… مورد استفاده قرار می گیرند (Ghaemi et al, 2005). منابع تولید آنزیم ها متنوع بوده و شامل گیاهان، جانوران و یاکتری ها می باشند که در بین آنها باکتری ها به عنوان منابع آنزیمی ترجیح داده می شوند (Kroner et al, 1984).
سراشیا مارسسنس مقدار زیادی از آنزیم های خارج سلولی از جمله نوکلئاز، همولیزین، پروتئاز و کیتیناز تولید می کنند که می توانند در بیماری زایی عفونت های فرصت طلب سراشیا مارسسنس دخالت داشته باشند (Letoffe et al, 1991). بطوریکه این باکتری پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند (Hase& Finkelstein, 1993).سراپپتیداز دارای خواص ضد التهابی قوی و در درمان تورم پس از ضربه و بیماری های پستان فیبروسیس و برونشیت بسیار مفید است. کاهش درد از دیگر ویژگی های آن است که علت آن توانایی در جلوگیری از آزاد شدن آمین های القا کننده درد از بافت های ملتهب است (Mazzone et al, 1990). بنابراین با توجه به مزایای فوق می توان از آن به عنوان یک آنزیم دارویی استفاده کرد.
در این مطالعه پرایمرهایی طراحی شده است بطوریکه نکات زیر بایستی مورد توجه قرار گیرد تا طراحی بهینه به انجام برسد:
به طور کلی درصد C+G دو پرایمر در حالت بهینه بین ۶۰-۴۰ درصد است. در یک پرایمر از تکرار پورین و یا پیریمیدین و یا تکرار دو نوکلئوتیدی باید اجتناب شود. ترتیب‌های تکراری معکوس یا خود مکمل بیش از سه نوکلئوتید باعث ایجاد ساختار سنجاق سرشده و مانع اتصال پرایمر به توالی هدف می‌شوند، لذا از چنین توالی‌های باید اجتناب نمود. انتهای ۳’ پرایمر نباید مکمل ناحیه‌ای در پرایمر دیگر باشد زیرا موجب تشکیل هیبریدی از دو پرایمر می‌شود.به طور کلی حداکثر سه نوکلئوتید در پرایمر می‌تواند مکمل ناحیه‌ای از پرایمر دیگر باشد. به علاوه طول پرایمر بین ۲۵-۱۸ نوکلئوتید بوده و تفاوت طول دو پرایمر نباید بیش از سه نوکلئوتید باشد. ضمناً اختلاف Tm دو پرایمر با هم و با قطعه تکثیر شده نباید به ترتیب بیش از ۵ و ۱۰ درجه سانتی گراد باشد.
در این پژوهش آنزیم پروتئولیتیکی سراپپتیداز که از باکتری سراشیا مارسسنس جدا شده بود، مورد مطالعه قرار گفت. این آنزیم در دمای ۴۵ درچه سانتی گراد و ۷pH پایدار بوده و خصوصیات مطلوبی برای کاربرد های بیوتکنولوژی دارد. در این تحقیق سیستم بیانیpET برای تولید آنزیم پروتئاز نوترکیب استفاده شد. ابتداقطعه bp 1500 در وکتور کلونینگPTZ57R/T به علت دارا بودن دنباله T کلون گردید و پلاسمید نوترکیب استخراج و خالص سازی گردید و باند مورد نظر روی ژل مشاهده شد و برای تعیین توالی ارسال گردید و پرایمرها بر اساس توالی ژنهایSerratia marcescens ZF03و Serratia marcescens HR-3 استخراج شده از GenBank و مقایسه آنها با هم از طریق بررسی همولوژی بین آنها طراحی شد.
در مرحله بعدی بعد از اینکه باند ۱۵۰۰ روی ژل الکتروفورز مشاهده شد، جهت ساب کلونینگ پرایمرهای با سایت برش برای آنزیم های در دو انتهای ژن طراحی شدند برای این کار، توالی ژن در سایت NEBcutter مورد بررسی قرار گرفت. تایید صحت کلونینگ و ساب کلونینگ با استفاده از PCRژن سراپپتیداز و هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم های طراحی شده درون سکانس پرایمرها مورد بررسی قرار گرفت. همچنین باید دقت داشت که اندازه محصول PCRبه دلیل داشتن سایت های برشی آنزیم های محدودالاثر، کمی بیشتر از مقدار مورد انتظار است. وکتورهای pETقوی ترین سیستم کلون و بیان پروتئین های نوترکیب در E.coli هستند که تا به امروز تهیه شده اند. توضیحات بیشتر در این رابطه در قسمت های بعدی آورده شده است.
ژن موردنظر می تواند در سیستم بیانی pET کلون شده و باکتری BL21 توسط وکتور نوترکیب مذکور ترانسفورم شود و در اثر القاء توسط IPTG بیان شود. در E.coli لاکتوز می تواند به الولاکتوز تبدیل شود و IPTG آنالوگ آن است که قادر به القای لاکتوز و پروموتورهای مشتق شده از آن برای بیان ژن مورد نظر است. به منظور تخلیص پروتئین نوترکیب موردنظر به دلیل دارا بودن توالی His-Tag از ستون تمایلی نیکل استفاده شد، چرا که این اسیدآمینه تمایل زیادی به نیکل دارد. با توجه به تجربیات افراد در این زمینه بهترین غلظت و دمای بیان این وکتور را غلظت یک میلی مولار IPTG و دمای ۳۰ درجه سانتی گراد گزارش دادند، ما نیز به همین صورت عمل کردیم و بعد مایع رویی و رسوب حاصل را از لیز سلول ها که به وسیله غلظت یک میلی مولار IPTG القاء شده بود را روی ژل SDS-PAGE مورد بررسی قرار دادیم.
به منظور دستیابی به بیان بیشتر آنزیم، از باکتری گرم منفی اشرشیا کولی به عنوان میزبان استفاده شد. با توجه به اینکه اشرشیا کولی دارای ویژگی های متعددی از جمله رشد سریع، محیط کشت ارزان، تکثیر آسان وکتورهای کلونینگ در خود و سابقه طولانی در زمینه کلونینگ و بیان و میزان تولید بالای پروتئین و مقرون به صرفه بودن آن می باشد، به عنوان یک سیستم بیانی مناسب کاربرد فراوان دارد.
وکتورهای بیانی مختلفی جهت بیان ژن در باکتری اشرشیا کولی گسترش یافته است. از این جمله می توان از وکتورهای pET نام برد. در این وکتورها جهت بان ژن مورد نظر از پروموتر باکتریوفاژ T7 استفاده می شود. پروموتر T7 بسیار قوی بوده و توسط RNA پلی مرازهای اشرشیا کولی شناسایی نمی شود، بنابراین با استفاده از وکتورهای pET به طور اختصاصی و به میزان زیاد ژن مورد نظر بیان می گردد. پروتئین های نوترکیب حاوی بر چسب هیستیدین به راحتی توسط ستون ها یا رزین های Ni-NTA خالص می شود.
بعلاوه به منظور بررسی خصوصیات صنعتی این آنزیم اثر فاکتورهای مختلف محیطی بر روی فعالیت و پایداری آنزیم بررسی شد. بررسی فعالیت آنزیم در دماهای مختلف و رسم منحنی دمایی که در شکل آمده است، نشان می دهد که درجه بهینه فعالیت آنزیم ۴۵ درجه سانتیگراد است ولی از دماهای بالاتر از ۵۵ درجه سانتی گراد هیچ گونه فعالیتی مشاهده نشد. همچنین این آنزیم در pH 10-5 دارای فعالیت می باشد اما pH بهینه آن ۷ است.
مقایسه نتایج بدست آمده توسط محققان دیگر در ارتباط با دما و pHبهینه پروتئازهای حاصل از سایر گونه های سراشیا نشان می دهد که دما و pH بهینه برایSerratia marcescens ATCC21074 به ترتیب ۵۰ درجه سانتی گراد و ۸ و برایSerratia sp. DT3 به ترتیب ۴۵-۴۰ و ۵/۹ می باشد (Kwon et al, 1993) و (Nguyen et al, 2006). همچنین دما و pH بهینه برای پروتئالیزین حاصل از Serratia proteamaculans به ترتیب حدود ۵۰ درجه سانتی گراد و ۷ می باشد (Demidyuk et al, 2006 ) و در مطالعه ای دیگر دمای بهینه پروتئازهای CP-1 و CP-2 حاصل از Serratia rubidaea به ترتیب۴۰ و۳۰ درجه سانتی گراد و pH بهینه آنها به ترتیب ۱۰ و ۸ می باشد (Doddapaneni et al, 2007). در گزارشی دیگر دما و pH بهینه برای متالوپروتئاز حاصل از Serratia marcescens به ترتیب ۴۵ درجه سانتی گراد و ۸٫۵ بوده است (Romero et al, 2001).
از مقایسه نتایج بدست آمده از این مطالعه با یافته های پژوهش های انجام شده بر روی پروتئازهای حاصل از سایر گونه های سراشیا می توان گفت به دلیل اینکه این آنزیم دارای دما و pH بهینه پایین تری نسبت به سایر آنزیم ها می باشد که به دلیل سازگاری با شرایط فیزیولوژیک بدن انسان می تواند در صنایع دارویی مورد استفاده قرار گیرد.
برای مطالعه پارامترهای سینتیکی آنزیم از سوبسترای کازئین استفاده شد. با رسم نمودار Michaelis-Mentenمحاسبه Km وVmax صورت گرفت. مقادیر Km وVmax برای سوبسترای کازئین به ترتیب
mM04/0و mM/min 17/0 است. در مطالعه دیگر Romero و همکارانش در سال ۲۰۰۱ گزارش کردند متالوپروتئاز حاصل از سراشیا مارسسنس دارای Km=0. 849 μM و Vmax= 505.64 μmol mg per protein min_1 می باشد (Romero et al, 2001).
از آنجایی که هر چه Kmبرای یک آنزیم پایین تر باشد تمایل آنزیم به سوبسترا بیشتر می شود و با توجه به اینکه آنزیم مورد مطالعه نیز دارای km کوچکتری می باشد، با سوسبترای کم می تواند حداکثر فعالیت را داشته باشد.
در این تحقیق به کمک توالی های مشابه در گونه های شناخته شده باکتری سراشیا مارسسنس و با توجه به عدم وجود سایت برش آنزیم های محدود کننده Nde1 و Xho1 در داخل ژنوم آنزیم سراپپتیداز، سایت برش این آنزیم ها بر روی پرایمر تعبیه شد. وکتور Pet-28 aبرای کلون سازی انتخاب شد که دارای اندازه ۵۳۶۹bp بوده و سایت های برش آنزیمی Nde1 و Xho1 بر روی آن وجود داشت. میزان تکثیر بالا از خصوصیات این وکتور است. انتخاب این وکتور به کمک مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین صورت می گیرد.
پس از کلون سازی و تعیین توالی و با توجه به نتایج BLASTبیشترین شباهت با ۹۹% همانندی با Serratia marcescens ZhenJiangکه توسط Cao و همکارانش در سال ۲۰۰۸ گزارش شده (Cao et al, 2008) و ۹۸% شباهت با Serratia marcescens HR-3که توسط Tao و همکارانش در سال ۲۰۰۷ تعیین توالی شده است در باکتری سراشیا مارسسنس مشاهده گردید (Tao et al, 2007).
۵-۱ نتیجه گیری نهایی
با بیان آنزیم سراپپتیدار کلون شده در این تحقیق و بررسی های ساختاری-عملکردی متعاقب آن کاربرد بیشتر این آنزیم در بیوتکنولوژی و صنعت می تواند مورد توجه قرار گیرد. از آنجایی که آنزیم سراپپتیداز دارای مزایای ضد التهابی و ضد درد می باشد، می تواند در صنایع دارویی مورد استفاده قرار گیرد.
۵-۲ پیشنهادات
جهش هدفدار به منظور افزایش فعالیت آنزیم.
بررسی ساختار دوم و سوم آنزیم با استفاده از تکنیک های فلورسانس و CD.
بهینه کردن شرایط بیان به منظور افزایش میزان تولید آنزیم.
منابع و مأخذ

  1. Aehle W. Enzymes in industry, Wiely-VCH Verlag GmbH Co. KgaA, Weinheim, 2004.
  2. Anwar, A. And Saleemuddin, M. 1998. Alkaline proteases: A Review, Bioresource Technology. 64:175-183
  3. Ashie I.N.A. )2003(, Bioprocess Engineering of Enzymes, Food Technol. 57, 44-51
  4. Asmaa A, Hameed M, Nooria A (2011). Molecularcloning and expression of Bacillusstearothermophilusprotease gene in E.coli, Journal of biology and life sciences, 2(1):26-31
  5. Banyx F.) 1999(, Recombinant protein expression in E.coli, Curr. Opin. Biotechnol.10. 411-21
  6. Boger DL, Patel M) 1988(, Total synthesis of prodigiosin, prodigiosene, and desmethoxyprodigiosin: Diels-Alder reactions of heterocyclic azidenes and development of an effective palladium (II)-promoted 2’2′-bipyrrole coupling procedure. Org Chem, 53:1405-1415
  7. دانلود متن کامل پایان نامه در سایت jemo.ir موجود است